忧遁草中黄酮苷的分离纯化以及对上皮性卵巢癌抗肿瘤作用的研究

隋红梅 贺凤喜 李爱华 李爱峰 王丽 路焕喜

1聊城市妇幼保健院妇科，聊城 252000；2聊城市人民医院妇产科，聊城 252000；3聊城大学化学化工学院，聊城 252000；4聊城市东昌府区人民医院妇科，聊城 252000通信作者：李爱华，Email：18663529788@126.com；李爱峰，Email：lxpsdta2001@sina.com

晚期上皮性卵巢癌具有高复发率、高病死率的特点［1］，铂耐药是所有患者的共同归宿，也是主要致死原因［2-3］，寻找新型抗肿瘤药物成为亟待解决的问题。忧遁草是一种传统中药材，广泛分布于我国南部至西南部地区［4］，黄酮苷是其主要成分，对多种癌症有抑制作用，如：乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肺癌等［5］，但在上皮性卵巢癌中的研究中鲜有报道。本研究（研究时间：2019 年10 月至2022 年3 月）旨在分离纯化忧遁草中的黄酮苷成分，探讨其对于上皮性卵巢癌的作用及潜在机制，为卵巢癌的化学药物治疗及忧遁草药用价值的开发提供理论依据。

材料与方法

1、实验材料

上皮性卵巢癌细胞A2780、SKOV3、OVCAR3 均由聊城市人民医院中心实验室提供；DMEM 高糖培养基、CCK-8（cell counting kit-8）试剂盒、总RNA提取试剂（Trizol）、M-MuLV 第一链cDNA 合成试剂盒（B532435）、2xSG Fast qPCR Master Mix（Low Rox）（B639272）、GAPDH

引物（正向：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'；反向：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'）、Bcl-2 引物（正向 ：5'-GACTTCGCCGAGATGTCCAG-3' ；反 向 ：5'-GAACTCAAAGAAGGCCACAATC-3'）、Beclin-1 引物（正向：5'-ACATCTGGCACAGTGGACAGTTTG-3' ；反 向：5'-AGCATGGAGCAGCAACACAGTC-3'）、RIPA 裂解液、5X蛋白加样缓冲液、Anti-BECN1 antibody、HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG、Anti-BCL2（Pho-spho-Thr69）antibody、HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG、蛋白预染Maker、苯甲基磺酰氟、30%Acr-Bis（29：1）溶液、1M Tris-HCL，pH=8.8、10%SDS 溶 液、1M Tris-HCL，pH=6.8、10X Tris-Glycine SDS-PAGE 电泳缓冲液、10X 印迹膜转印缓冲液、PVDF 印迹膜、10X TBST WB 漂洗液、Annexin V 凋亡检测试剂盒（均购至生工生物工程股份有限公司）。

2、实验方法

2.1、忧遁草中黄酮苷的提取、分离纯化和鉴定 将忧遁草粉碎，用20 倍量75%乙醇超声提取3 次，每次30 min，过滤，提取液经减压浓缩得粗提物。用HPD-100 型大孔吸附树脂对粗提物中的黄酮苷进行富集，上样后首先用水洗脱10 个柱体积以除去强极性杂质，再用40%乙醇-水溶液洗脱7 个柱体积将黄酮苷洗脱下来。用半制备型高效液相色谱仪对富集后的黄酮苷进行分离纯化，色谱柱为C18（250.0 mm×25.4 mm，10 μm），流动相为甲醇-水（34：66，V/V），流速为25 ml/min，检测波长为330 nm，柱温为室温。根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂，其纯度用高效液相色谱法进行检测，化学结构经核磁共振波谱分析进行鉴定。

2.2、细胞培养 使用含10%灭活胎牛血清和1%双抗（青霉素/链霉素）的DMEM 培养基培养传代细胞，于5%CO2、37 ℃恒温细胞培养箱中培养。细胞传代时使用0.25%的胰蛋白酶消化贴壁细胞，DMEM 培养基终止消化并离心，DMEM重悬后接种于培养皿中。

2.3、细胞增殖实验 应用CCK-8 法检测细胞增殖。取对数生长期的卵巢癌细胞消化离心，以每孔5×104个细胞均匀接种于96 孔板中，并放置在培养箱中培养过夜。将忧遁草黄酮苷提取物用甲醛溶解，按照10 μg/μl、20 μg/μl、40 μg/μl、60 μg/μl、80 μg/μl、100 μg/μl 的浓度梯度作用于细胞，每个浓度有3个副孔，分别处理24 h、48 h。然后向每孔中加入CCK-8溶液（每孔100 μl 加 入10 μl CCK-8 溶液）。以加入等体积的磷酸盐缓冲液（PBS）作为空白对照组。在37 ℃孵育2 h 后，用酶标仪测定450 nm 处的吸光值（OD）。

2.4、细胞凋亡检测 选取对数生长期的细胞，将上皮性卵巢癌细胞用DMEM 完全培养基制成单细胞悬浮液，用血球计数板计数，调整细胞密度为1×105个/ml，接种5 ml 于T25培养瓶中，放置在环境温度为37 ℃、CO2浓度为5%的孵化箱中24 h，使细胞贴壁。将提取物以不同的浓度作用于细胞，置入5%CO2孵箱37 ℃培养24 h，进行细胞计数，使每管中含有1×106个细胞。根据Annexin V Binding Apoptosis Assay Kit（E607127）试剂盒说明书进行操作，用流式细胞分析仪检测细胞凋亡率。

2.5、荧光定量PCR 检测 根据RNA 提取试剂盒说明书，将经忧遁草黄酮苷提取物处理后的细胞进行RNA 提取，根据M-MuLV 第一链cDNA 合成试剂盒（B532435）说明书操作进行反转录合成cDNA，实时荧光定量PCR 检测Bcl-2 与Beclin-1 的mRNA 相对表达量，mRNA 的相对表达量按照公式2–ΔΔCt计算。

2.6、Western-blot 检测 提取经忧遁草黄酮苷提取物处理后细胞中的总蛋白，BCA 法检测蛋白的浓度，加入适量蛋白上样缓冲液，调整为相同蛋白浓度。SDS-PAGE 电泳后将蛋白条带转印至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h 后，分别加入Bcl-2、Beclin-1 的一抗，4 ℃孵育过夜。TBST 洗膜3 次后加入二抗，室温孵育1 h 后，再用TBST 洗膜3 次。在PVDF膜上加入适量的显影液，在蛋白显影仪显影。实验重复3次。

3、统计学分析

使用统计软件SPSS 22.0、GraphPad Prism 对实验结果进行统计学分析。应用单因素方差分析进行细胞半抑制浓度（IC50）值的测定，应用GraphPad Prism 进行作图分析，符合正态分布的计量资料以（）表示，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

结果

1、忧遁草中黄酮苷的结构鉴定

经核磁共振波谱3 种黄酮苷分析为：肥皂草苷、夏佛塔苷和牡荆苷，化学结构式见图1。相关成果已获国家级发明专利（专利号：ZL 2019 1 0261971.4）。

图1 忧遁草中3种黄酮苷的化学结构式（A为肥皂草苷，B为夏佛塔，C为苷牡荆苷）

2、忧遁草黄酮苷对上皮性卵巢癌细胞的增殖影响

CCK-8 实验结果显示，和空白组相比，经3 种不同忧遁草黄酮苷提取物处理24 h 后，牡荆苷对上皮性卵巢癌细胞具有明显增殖抑制作用（P<0.05），而肥皂草苷、夏佛塔苷对上皮性卵巢癌细胞无明显增殖抑制作用（图2）。牡荆苷对上皮性卵巢癌细胞SKOV3、OVCAR3、A2780 的IC50值分别为33.777 μg/μl、34.114 μg/μl、31.968 μg/μl。这说明牡荆苷对上皮性卵巢癌具有抗癌活性，后续研究以牡荆苷为研究对象。

图2 忧遁草中黄酮苷提取物对上皮性卵巢癌细胞的增殖影响(A为肥皂草苷，B为夏佛塔苷，C为牡荆苷)

3、牡荆苷对上皮性卵巢癌细胞SKOV3、A2780、OVCAR3中Beclin-1、Bcl-2 mRNA表达的影响

与空白组相比，经牡荆苷处理后，上皮性卵巢癌细胞SKOV3、A2780、OVCAR3 组Beclin-1 mRNA 相对表达量增加，Bcl-2 mRNA 相对表达量降低，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。后续研究以SKOV3为研究对象。

表1 忧遁草提取物牡荆苷对上皮性卵巢癌细胞Beclin-1、Bcl-2 mRNA表达的影响

4、牡荆苷对上皮性卵巢癌细胞SKOV3 的生长抑制作用

以不同浓度的牡荆苷（0、20、30、40 μg/μl）分别处理卵巢癌SKOV3 细胞24 h 后，使用Annexin V Binding Apoptosis Assay Kit 试剂盒进行检测忧遁草提取物牡荆苷对上皮性卵巢癌细胞的生长抑制作用。结果显示：随着牡荆苷浓度的增加，其对上皮性卵巢癌细胞SKOV3 的生长抑制作用越显著（P<0.01）。见图3。

图3 忧遁草黄酮苷提取物牡荆苷对上皮性卵巢癌细胞的生长抑制作用（A为流式细胞检测图，B为细胞凋亡率柱状图）

5、忧遁草提取物牡荆苷对上皮性卵巢癌细胞SKOV3中Beclin-1、Bcl-2蛋白表达的影响

经牡荆苷处理后，通过Western-Bolt技术检测空白组和药物组中Beclin-1、Bcl-2 蛋白的表达情况，结果显示：经牡荆苷处理后，上皮性卵巢癌细胞SKOV3 中Beclin-1 蛋白表达显著升高（P<0.01），Bcl-2 蛋白表达明显减少（P<0.01）。见图4。

图4 忧遁草提取物牡荆苷对上皮性卵巢癌细胞中Beclin-1 和Bcl-2 蛋白表达的影响（空白对照组：加入等体积的磷酸盐缓冲液，药物组：Beclin-1 和Bcl-2 蛋白抗体滴液1∶5 000）

讨论

晚期卵巢癌是一个多次复发的“慢性”疾病，70%的患者停止化疗后3 年内复发，需要接受二线乃至多线治疗，随着复发次数增加，无进展生存期逐渐缩短，蓄积毒性日益显著，最终发展为对铂类耐药［6-7］。铂耐药患者预后差，化疗推荐非铂方案，总有效率不足20%，中位无进展生存期3～4 个月，中位总生存时间不足12 个月。中药有效成分在抗肿瘤方面有独特优势，具有多途径、多靶点、低毒性的特点，开发新型抗肿瘤药物已成为了卵巢癌研究的热点。

1、忧遁草中牡荆苷对上皮性卵巢癌细胞具有明显增殖抑制作用

忧遁草是一种多年生草本植物，具有很高的药用价值，研究表明忧遁草具有多种生物活性［5，8］，如抗炎、抗氧化、免疫调节、抑制肿瘤生长等。本研究从忧遁草中分离提纯出3 种黄酮苷化合物，分别为肥皂草苷、夏佛塔苷和牡荆苷（相关成果已获国家级发明专利，专利号：ZL 2019 1 0261971.4），CCK-8 实验结果表明，经3 种提取物处理后，仅牡荆苷对上皮性卵巢癌细胞具有明显增殖抑制作用，肥皂草苷、夏佛塔苷无明显增殖抑制作用，说明忧遁草中黄酮苷化合物的异质性。

2、忧遁草中牡荆苷通过促进卵巢癌细胞凋亡发挥抗肿瘤作用

细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种主要形式，在调节多细胞生长、发育和维持细胞稳定数量过程中发挥重要作用［9-10］，细胞凋亡一旦受抑制，就会导致肿瘤的发生和进展［9，11］。研究发现Bcl-2 家族是细胞凋亡的关键调节因子，定位于线粒体、内质网及核膜的细胞质上［12］，Bcl-2 在多种肿瘤细胞表达升高，通过抑制细胞程序性死亡，促进癌症的发生［10，13］。本研究结果显示，牡荆苷对上皮性卵巢癌细胞具有明显增殖抑制作用（P<0.05），并随着牡荆苷浓度的增加，生长抑制作用越显著（P<0.01），表明牡荆苷的生长抑制作用呈剂量-时间依赖性；经牡荆苷处理后，上皮性卵巢癌细胞Bcl-2 mRNA 相对表达量降低（P<0.01），Bcl-2 蛋白表达明显减少（P<0.01）。可见，忧遁草中牡荆苷通过促进细胞凋亡发挥抗肿瘤作用，这与Zhao 等［14］研究结论一致。同样，也有研究发现忧遁草提取物对MCF-7 乳腺癌细胞具有抗增殖活性，可有效缩小4T1 乳腺癌小鼠模型肿瘤体积［15］，另外，也有研究证实忧遁草提取物可影响宫颈癌Hela 细胞的增殖，诱导细胞周期停滞和细胞凋亡［16］。

3、忧遁草中牡荆苷通过调节Bcl-2 与Beclin-1 的相互作用控制卵巢癌细胞自噬，促进细胞凋亡

细胞自噬又称Ⅱ型程序性细胞死亡［17］，是一把双刃剑，具有保护和破坏作用，一方面通过溶酶体途径去除受损的细胞器、有毒代谢物和病原体，并产生能量维持细胞的生存，另一方面，细胞内重要成分的过度自我消化和降解也会导致细胞死亡［13］。细胞自噬与肿瘤的关系非常密切，在肿瘤发生的初期阶段，细胞自噬可抑制肿瘤的发生，随着肿瘤进展，自噬可促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡、促进肿瘤细胞发生转移，还可通过促血管生成促进肿瘤细胞生长［9，11］。

Beclin-1是第1个被发现参与自噬过程的基因，定位于人类第17q21 号染色体，在自噬中发挥核心作用［17］，编码Beclin-1 蛋白，是启动自噬体形成的必需蛋白，调控自噬前体的形成［9，17］。Beclin-1 最初是作为Bcl-2 的交互蛋白被分离出来，近年来研究发现Bcl-2通过与Beclin-1相互作用发挥抗自噬作用，Beclin-1/Bcl-2 复合物在细胞中起着变阻器功能，Bcl-2不仅通过与含有BH3结构域的促凋亡蛋白结合来抑制细胞凋亡，而且通过与Beclin-1 的BH3 结构域结合，调节生长因子信号，调节自噬，BH3结构域可能是一个共同的结构基序，Bcl-2家族成员通过该结构域识别并双重调节凋亡和自噬分子［11，17］，抗凋亡蛋白Bcl-2与自噬蛋白Beclin-1 的相互作用是研究细胞凋亡与自噬机制的潜在靶点。

本研究采用Bcl-2、Beclin-1 作为标志物，发现牡荆苷对上皮性卵巢癌细胞增殖有显著抑制作用，药物组Bcl-2基因相对表达量降低，说明牡荆苷可能在基因水平调控细胞增殖，诱导细胞凋亡；牡荆苷作用后肿瘤细胞Beclin-1 基因相对表达量升高，提示Beclin-1 基因可能通过参与自噬，加速了细胞凋亡的进程。通过Western Blot 法检测细胞中Bcl-2、Beclin-1 蛋白表达情况，发现药物组卵巢癌细胞Bcl-2 蛋白表达量降低，Beclin-1 蛋白表达量升高，说明牡荆苷在蛋白质水平同样影响了卵巢癌细胞的增殖活性，加速了肿瘤细胞的凋亡。可见，Bcl-2/Beclin-1 复合物可能是一个变阻器，通过调节Bcl-2 与Beclin-1 的相互作用，不仅控制细胞自噬水平，而且控制自噬基因依赖性细胞死亡。

综上所述，本研究结果支持忧遁草黄酮苷提取物牡荆苷具有抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖的作用，通过降低Bcl-2 基因和蛋白的表达，升高Beclin-1 基因和蛋白的表达来控制细胞自噬，促进细胞凋亡，达到抑制肿瘤发展的作用。提示抗凋亡蛋白Bcl-2 与自噬蛋白Beclin-1 的相互作用是上皮性卵巢癌治疗的潜在靶点，为开发忧遁草抗肿瘤药用价值提供了基础依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突