地衣芽孢杆菌发酵降解脱铬皮屑的条件优化研究

卢欣雨，张晓伟，张佳兴，赵胜宗，刘彦＊

（1.四川大学生物质与皮革工程系，四川成都 610065；2.四川大学制革清洁技术国家工程实验室，四川 成都 610065）

引言

我国是世界上最大的制革加工国，每年产生的制革固体废弃物约30 万吨[1]。由于处理和再利用方法的局限性，这些废弃物给环保带来了一定的压力。制革废弃物中的主要成分是重金属铬和胶原蛋白，如果对其进行适当的处理，每年至少有6 万吨胶原蛋白可以得到利用。目前，降解制革废弃物的主要方式有酸法、碱法[2]和酶法[3]、以及微生物法[4]。化学法是用制革废弃物制备有机肥料的主要方式[5-15]，但化学法不仅对化学试剂的消耗量大，还会引入大量的盐分杂质，同时产生的氨基酸、多肽基本无生物活性。而酶法得到的基本上是多肽，产物单一。与化学法和酶法相比，生物发酵法才是农业中制备有机肥料的主要方式。生物发酵制肥的条件温和，蛋白质经微生物发酵后可产生速效性的氨基酸、小分子肽、缓释性的多肽等产物，营养全面，且产物皆有生物活性，更容易为植物所吸收利用。农业使用的生物有机肥是以畜禽粪便、农作物秸秆、生活垃圾等有机废弃物为基质，经过无害化、腐熟处理而制成的一类兼具有机肥和微生物功效的肥料[16]，已经被广泛证明具有能够减少或代替部分化肥、农药的使用，增强作物抗逆性，改善作物品质，改良土壤等优势，同时兼具促进作物生长和防控土传病害功能[17]。因此，用微生物发酵降解制革废弃物来制备生物有机肥料比化学法和酶法更具有前景。

由于高含量的铬不利于微生物的繁殖生长，本研究拟采用脱铬皮屑进行发酵降解。脱铬皮屑的主要成分为胶原蛋白，微生物对其进行发酵降解后，会产生不同种类的游离氨基酸以及分子大小不一的多肽类物质，这些物质对植物的生长有促进和调节作用，因此，脱铬皮屑的发酵产物可以作为氨基酸肥使用，对植物发挥营养、促生的功效。本文将对地衣芽孢杆菌发酵脱铬皮屑的发酵条件进行优化，达到进一步提高脱铬皮屑水解率，增加发酵液中游离氨基酸含量的目的。将以发酵液中的游离氨基酸种类及含量评估发酵效果，并对其重金属含量进行测定，以评估脱铬皮屑发酵液作为生物有机缓释肥的可行性。

1 实验部分

1.1 主要材料与仪器

P-4 菌：取1 mL 自然降解的废皮液，用无菌水稀释后在明胶培养基上进行划线分离，在37 ℃下培养48 h。挑选出培养基上具有明显透明圈的单菌落，将其于液体种子培养基中活化12 h，取种子液在固体种子培养基上划线并培养24 h。将获取的单菌落通过点种接种到明胶培养基上，培养36 h，得到初筛菌株。将初筛菌株于液体种子培养基中培养24 h 后，以1%接种量接种到添加了一定量脱铬皮屑的发酵培养基中（比例为1 g 的脱铬皮屑加20 mL 的发酵培养基），培养24 h。发酵液中游离氨基含量最高的那组即为本实验所需的菌株，经16SrDNA 法鉴定可基本确定为地衣芽孢杆菌。

脱铬皮屑：本实验室自制[18]。将蓝湿皮碎块用打磨机粉碎成屑，以一定量的铬革屑为基重，加入10%的9 g/L 氧化钙和2000%的水，在25 ℃、120 r/min 的水浴振荡下，反应12 h 后抽滤。取滤屑，加入0.9 mol/L 的盐酸（固液比1∶20）处理35 min 后，离心去溶液后固体水洗数次，然后干燥至恒重。灰分含量为0.26%，总铬含量为0.819 mg/g，pH 值为7.0。

材料：试剂均为国产分析纯；牛肉膏、蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；SDS-PAGE 标准蛋白质（相对分子质量范围14～66 kDa），合肥博美生物。

仪器：SHA-B 双功能水浴恒温振荡器，常州市亿能实验仪器厂；HSP-80B 恒温恒湿培养箱，上海坤天实验仪器有限公司；SQP 电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；UV-1100 型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；PHS-3C 精密酸度计，上海仪分科学仪器有限公司；ICP-OES 等离子发射光谱仪，美国Perkin Elmer；DYY-2C 垂直板型电泳仪，北京六一生物科技有限公司；HG-AFS 氢化物发生原子荧光光谱仪，北京科创海光仪器有限公司。

1.2 实验内容与方法

1.2.1 培养基

种子培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，水1000 mL。

明胶培养基：明胶25 g，磷酸二氢钾2 g，氯化钠5 g，七水硫酸镁0.2 g，琼脂20 g，水1000 mL。

发酵培养基：酵母粉2.5 g，葡萄糖5 g，磷酸氢二钾14 g，磷酸二氢钾6 g，氯化钠5 g，七水硫酸镁0.2 g，柠檬酸钠1 g，硫酸铵2 g，琼脂20 g，水1000 mL。

培养基的pH 均用氢氧化钠调到8.0。

1.2.2 发酵条件研究

挑取在平板划线中生长良好的P-4 菌单菌落，接种到已灭菌的液体种子培养基（20 mL）中，置于37 ℃、120 r/min 的恒温振荡水浴器中培养。

1.2.2.1 接种菌龄[19]

每隔4 个小时取一次样，以蒸馏水作空白，在600 nm 波长下测定OD 值，至数值基本不变后停止取样，以OD 值和培养时长为坐标轴绘制P-4 菌的生长曲线图。

1.2.2.2 固液比

培养24 h，取种子液备用。称取一定量的脱铬皮屑，与发酵培养基按照1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25 的比例进行混合，即1 g 的脱铬皮屑分别加5、10、15、20 和25 mL 的发酵培养基，下同。混匀后调pH 值至8.0，置于121 ℃的灭菌锅中灭菌20 min。冷却后以1%的接种量接入种子液，置于37℃、120 r/min 的恒温振荡水浴器中培养24 h 后测定游离氨基的含量。

1.2.2.3 接种量、最适温度、最适pH

培养24 h，取种子液备用。脱铬皮屑与发酵培养基按照1∶15 的比例进行混合（同1.2.2.2），混匀后调节pH 值至8.0（7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0），置于121℃的灭菌锅中灭菌20 min。冷却后以0.5%(0.5%、1%、2%、3%、4%)的接种量接入种子液，置于恒温振荡水浴器中，在37 ℃(27、32、37、42、47 ℃)、120 r/min 下培养，每6 个小时取一次样，并测定相应时间下游离氨基的含量。

1.2.2.4 发酵时间

调pH 值为9.0，其余步骤同1.2.2.3。

1.2.3 发酵液中游离氨基的测定[20-21]

茚三酮溶液：称取0.5 g 茚三酮，用无水乙醇溶解并定容于100 mL 棕色容量瓶中；乙酸-乙酸钠缓冲液：称取120.0 g 乙酸钠，加入4.0 mL 无水乙酸，加水定容于1000 mL 容量瓶中；碘酸钾溶液：称取0.3 g 碘酸钾，加入90 mL 蒸馏水溶解后加60 mL无水乙醇；标准溶液：称取0.1 g 甘氨酸，加水定容于100 mL 棕色容量瓶中，再分别取0、1、2、3、4、5 mL 该甘氨酸溶液于100 mL 容量瓶中定容。

准确吸取1 mL 标准溶液分别置于6 支比色管中，依次加入1 mL 缓冲液和茚三酮溶液，封好摇匀后于沸水浴中加热15 min，取出放到冷水中冷却15 min。再分别加入5 mL 碘酸钾溶液，用蒸馏水定容至10 mL。将波长调至568 nm，用空白样调零，再依次测出其余样品的吸光度。以游离氨基含量和吸光度为坐标轴绘制标准曲线，得到线性回归方程。将标准溶液换成稀释后的发酵液，其吸光度的测定同上。根据上述线性回归方程得到游离氨基的含量。

1.2.4 发酵产物主要成分分析

脱铬皮屑在其最优条件下发酵后，对发酵液的主要成分进行测定。

1.2.4.1 重金属含量

按照DB33/T 647—2007 中硝酸-高氯酸湿法对发酵液进行消解，用ICP-OES 法测定样品中镉、铬、铅的含量；按照NY/T 1978-2010 中原子荧光光谱法检测样品中汞、砷的含量[22]。

1.2.4.2 游离氨基酸种类及含量

于带有过滤膜的小离心管中放入400 μL 发酵液，100 μL 10%磺基水杨酸，混匀，置于冰箱中在2～8 ℃下静置冷藏60 min。然后将其置于离心机中以5000 r/min 离心15 min，接着取上层清液再次以5000 r/min 离心5 min。离心结束后，取上清液，根据发酵液中游离氨基酸的大概浓度，对发酵液进行稀释，使得其游离氨基酸浓度在50～250 nmol/mL 之间。样品稀释后，用0.22 μm 滤膜过滤，在A300 全自动氨基酸分析仪上进行氨基酸分析。

1.2.4.3 多肽含量[23]

采用双缩脲法测定。取6 支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mL 的5 mg/mL 标准蛋白溶液，用水补足到1 mL。再加入4 mL 的双缩脲试剂，充分摇匀后于25 ℃下静置30 min。在540 nm 的波长下测定吸光度，以牛血清蛋白含量和吸光度为坐标轴绘制标准曲线，得到线性回归方程。

取2 mL 发酵液，加入2 mL 15%三氯乙酸，混匀后静置10 min，以5000 r/min 离心10 min。取1 mL经适度稀释的上清液，余下步骤同上。根据标准曲线中的线性关系，将发酵液的吸光度换算为相应的多肽含量。

1.2.4.4 蛋白质相对分子质量的分布

开始发酵后每12 h 取一次样，采用SDS-PAGE凝胶电泳法测定不同时间点下蛋白质相对分子质量的分布。制胶配方如表1 所示，制胶完成后，用微量注射器分别取适量Marker 和处理好的样品注入进样槽中。接通电源，设置电压为80 V，待样品进入分离胶时，调节电压至150 V。待溴酚蓝色染料距离凝胶边缘约1～2 cm 时，结束电泳。关掉电源，取出胶片，胶片经染色、脱色后得到清晰的蛋白质条带。

表1 SDS-PAGE 法制胶配方Tab. 1 Gel formula of SDS-PAGE

2 结果与讨论

在发酵降解的过程中，发酵条件是影响微生物发酵生产水平的重要因素，主要为菌龄、接种量、温度、pH 和时间等，这些条件的改变都会直接影响发酵的结果[24]。温度和pH 值是影响菌株生长和代谢体系酶活最主要的因素，每一种菌都有自己最适宜的温度和pH，一旦偏离了其最适值，均可能造成发酵产物产量的急剧降低和发酵的失败。发酵时间是获取产物种类和数量的重要指标，尤其是产物为中间代谢产物的，控制不当就有可能造成其被微生物利用掉的后果，最终造成发酵目标产物产率低下。因此，根据发酵最终产物的不同对发酵条件进行研究和优化是提高其产量的有效方式之一。

2.1 发酵条件优化结果

2.1.1 接种菌龄

由图1 可知，OD 值在0～4 h 增长缓慢，P-4 菌处于延滞期；4～24 h 期间OD 值呈近直线型增长，P-4 菌处于对数生长期；24 h 后P-4 菌开始步入稳定期。对数生长期后期的菌株生长和代谢能力旺盛，菌株数量基本达到了最高，因此选取24 h 作为P-4 菌的接种菌龄。

图1 P-4 菌株生长曲线Fig. 1 Growth curve of strain P-4

2.1.2 固液比

图2 数据显示，发酵液中游离氨基含量随着固液比的增大而明显增加，在1∶15 时达到最高，当继续增大后含量趋于平缓。这是因为固液比太小时，发酵液中有机营养浓度过高，发酵液黏度过大而溶氧不足，抑制了微生物的生长和代谢。同时，固液比过大对产物量的增加没有促进作用，反而会增加发酵罐的载荷负担和水耗量。因此，最佳固液比为1∶15。

图2 固液比对脱铬皮屑水解的影响Fig. 2 The effect of solid-liquid ratio on hydrolysis of dechromed shavings

2.1.3 接种量

由图3 可知，发酵6～24 h 时接种量越大，发酵液中的游离氨基含量越高；超过24 h 后，不同接种量的发酵液中游离氨基含量之间几乎无差异。这可能是因为在发酵前期，接种量越大，发酵液中的活菌数量越多，产生的游离氨基含量就越高，但随着发酵时间的延长，活菌数量趋于相同，导致其游离氨基含量差异越来越小。在接种量为0.5%的基础上继续增大接种量并没有增加游离氨基含量，反而浪费种子液，增加发酵成本，因此接种量取0.5%。

图3 接种量对脱铬皮屑水解的影响Fig. 3 The effect of inoculation amount on hydrolysis of dechromed shavings

2.1.4 最适温度

图4 显示，在同一发酵时间点下，不同温度的发酵液游离氨基含量并不都随温度的升高而增加。温度过高或过低都会影响P-4 菌株的代谢活动，导致游离氨基含量较低。因此可以看出，37 ℃是P-4菌株降解脱铬皮屑的最适温度。

图4 温度对脱铬皮屑水解的影响Fig. 4 The effect of temperature on hydrolysis of dechromed shavings

2.1.5 最适pH

由图5 可以看出，pH 对脱铬皮屑水解的影响与发酵温度的影响规律相似，说明pH 过高或过低都会影响P-4 菌株的代谢活动，从而影响发酵液中的游离氨基含量。此实验范围内，9 是P-4 菌株降解脱铬皮屑的最适pH 值

图5 pH 对脱铬皮屑水解的影响Fig. 5 The effect of pH on hydrolysis of dechromed shavings

2.1.6 发酵时间

由图6 可以看出，发酵12～24 h 时，发酵液中的游离氨基含量急速上升，此时P-4 菌株的代谢非常活跃，菌株不断地分泌胞外蛋白酶，使得脱铬皮屑由大分子的蛋白质逐渐分解为小相对分子质量的游离氨基酸和多肽；发酵24～48 h，游离氨基含量上升变缓，于48 h 时达到最高值。此时尽管P-4 菌株的代谢速度放缓，但氨基酸和多肽的产生速率还是远远高于菌株的代谢消耗速率，所以游离氨基的含量不断增加；发酵48～72 h，游离氨基含量出现缓慢下降的趋势。此时脱铬皮屑的生物降解基本完成，降解产生的小分子物质作为菌株的营养物质不断地被消耗，出现了产物阻遏效应。因此，P-4 菌株发酵48 h 时，游离氨基含量最高，发酵效果最佳。

图6 发酵时间对脱铬皮屑水解的影响Fig. 6 The effect of fermentation time on hydrolysis of dechromed shavings

综上所述，优化的发酵条件为：菌龄24 h，固液比1∶15，接种量0.5%，温度37 ℃，pH 9.0 和发酵时间48 h。

2.2 发酵产物成分的分析

脱铬皮屑发酵过后已经被水解成液体状态，无肉眼可见的皮屑等固体残留物。

2.2.1 重金属含量

由表2 可知，脱铬皮屑发酵液中未检测到汞、砷、镉、铅，而铬的含量也只有2.91 mg/kg，完全符合农业部标准NY 1110-2010 对水溶肥料的要求[25]。

表2 重金属含量Tab. 2 Contents of heavy metal

2.2.2 游离氨基酸

由表3 可知，发酵液中游离氨基酸质量浓度最高的为脯氨酸，其次为半胱氨酸、丙氨酸和组氨酸，这些氨基酸能够为植物生长提供快速营养供给。总氨基酸质量浓度达到了1 g/L，按照目前市售氨基酸肥料的施用质量浓度为100 mg/L 计，发酵液可以至少稀释10 倍后用于植物种植。

表3 游离氨基酸质量浓度Tab. 3 Contents of free amino acid

2.2.3 多肽含量

用三氯乙酸去除发酵液中的蛋白质分子后，采用双缩脲法，测得发酵结束时(48 h)发酵液中的多肽质量浓度为13.21 g/L。多肽同氨基酸一样，皆能够明显改善作物品质，提高作物产量以及增强作物的抗逆性。但多肽还具有缓释肥效的功能，能够更持久地为植物提供营养。因此，本实验制备的脱铬皮屑发酵液有希望用作营养均衡、丰富的植物营养液。

2.2.4 蛋白质相对分子质量的分布

图7 显示，发酵12 h 后，蛋白质条带呈清晰的连续状分布，且相对分子质量较大，基本都在20.0 kda 及以上，此时尚处于起始阶段；24 h 后，凝胶图上只有模糊的蛋白质条带，尤其是48 h 以后，在标准蛋白相对分子质量范围内基本看不到蛋白质条带，说明此时脱铬皮屑已被充分降解为相对分子质量更小的游离氨基酸和多肽，且多肽相对分子质量皆在14.4 kda 以下。由此可知，经过P-4 菌株发酵处理48 h 后，脱铬皮屑已经降解为氨基酸和小相对分子质量多肽，发酵液中大量存在的游离氨基酸可以为处于迅速生长期的植物提供快速均衡的营养保障，丰富的多肽含量还可为植物生长提供源源不断的缓释营养供给。

3 结论

（1）优化的P-4 菌株（地衣芽孢杆菌）发酵条件为：种子液菌龄24 h，固液比1∶15，接种量0.5%，温度37 ℃，pH 9.0 和发酵时间48 h。

（2）脱铬皮屑发酵液中未检测到汞、砷、镉和铅元素，铬质量分数为2.91 mg/kg，重金属含量皆达到了农业部国家标准。

（3）发酵液中游离氨基酸主要有脯氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和组氨酸，总游离氨基酸质量浓度达到了1 g/L。

（4）发酵液中总肽质量浓度为13.21 g/L，说明脱铬皮屑发酵液中含有较高浓度的游离氨基酸和大量的多肽类物质。

（5）脱铬皮屑在最优条件下发酵48 h 后，基本降解为游离氨基酸和相对分子质量更小的多肽类物质，且相对分子质量都在14.4 kda 以下，有望作为生物有机缓释肥促进植物的生长。