三黄跌打膏对急性软组织损伤大鼠的疗效及作用机制

姜新根 李若竹 胡莲花

急性软组织损伤多是由钝性或锐性暴力损伤所致，使患区出现疼痛、肿胀、功能性障碍等异常表现[1]。西医处理多进行肢体冷敷，口服或外敷消肿止痛药物，但整体效果不佳[2]。中医将急性软组织损伤归属于“筋伤”范畴，可单独出现，也可伴有骨折发生。目前，中医药对急性软组织损伤的治疗体现出无与伦比的优势，尤其是外用药膏，操作简单，携带方便，且不良反应小，受到诸多医学工作者的高度关注[3]。三黄跌打膏是由深圳市中医师王进东主任凭借30多年临床经验所制作出的名方，具有活血化瘀、消肿止痛、清热解毒功效[4]。虽为名方，在临床有一定应用，但基础研究甚少，尤其是具体机制，更是缺乏研究论证。故肯定了该研究的探索价值。现本实验通过建立急性软组织损伤大鼠模型，探讨三黄跌打膏的临床治疗效果及作用机制，为其在临床应用奠定坚实的理论基础。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

64只SD大鼠，SPF级，雌雄各半，体重220～240 g，平均（231.35±1.26）g；购于广东斯嘉景达生物科技有限公司[SCXK（粤）2020-0052]。饲养环境：华南农业大学实验动物中心屏障环境设施[SYXK（粤）2019-0136]，自由饮食、饮水，标准大鼠饲养适应性喂养，连续3 d，温度22～26 ℃，湿度40%～70%，昼夜交替时间各12 h。

1.2 仪器与试剂

JK-6型摊片机、JT-12J脱水机、JB-L5包埋机、JB-L5冻台、JK-6组织摊片机均购于武汉俊杰电子有限公司，HI 1220型烘片机购于德国徕卡公司，LEiCA RM2016型病理切片机购于上海徕卡仪器有限公司，DGX-9003B型烤箱购于上海福玛实验仪器有限公司，AggRAM型血小板聚集仪购于北京中昊万通科技有限公司，SA900型血流变分析仪购于赛科希德科技发展有限公司，Multiskan FC 型酶标仪购于Thermo Fisher公司。白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）定量分析酶联免疫试剂盒，购自安徽巧伊生物科技有限公司；前列腺素E2（PGE2）酶联免疫试剂盒，购自武汉华美生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 药物制备 三黄跌打膏：由大黄、黄连、黄柏、制天南星、赤小豆、樟脑组成，将大黄、黄连、黄柏、制天南星混合并研磨成粉末，过100目药筛。用5倍量纯净水浸泡赤小豆，连续浸泡30 min，先用大火煮开，再用小火继续煎煮30 min，然后收集煎煮药液。剩下药渣继续用5倍量纯净水煎煮，煎煮过程同第一次煎煮过程，过滤药液，混合第一次药液，继续煎煮药液，使其浓缩成含生药1 g/ml的浓缩液。樟脑用95%乙醇100 ml溶解，与含有赤小豆1 g/ml的浓缩液混匀，再取蜂蜜20 g溶至混合液内，搅拌均匀并调和大黄、黄连、黄柏、制天南星混合粉末，制成贴膏后置于4 ℃保存备用。

1.3.2 动物模型制备 64只大鼠适应性喂养3 d，其中16只大鼠继续正常喂养，未建立模型。其他建立模型：在模型建立1 d，将大鼠左侧臀部、大腿后侧毛发剔除干净，细小毛发用8%硫化钠清除干净。采用10%水合氯醛麻醉，采用200 g砝码，从50 cm高度自由落体，连续击打大鼠右后大腿肌肉丰厚部位，连续2次，使打击部位出现散在出血、肿胀、皮下瘀斑，皮肤无破损，无骨质，单侧肢体跛行，即造模成功。

1.3.3 分组及给药 48只大鼠分为3组，每组16只，即模型对照组（未予以干预）、三黄跌打膏组、狗皮膏药组。给药组：在造模成功后1 h给予相应药物包扎，以特制胶布及纱布固定，换药1次/d，连续7 d。

1.4 观察指标

1.4.1 病理组织学检查 在第3、7 d将取血后的大鼠采用牵引脱臼方法处死后，以打击点为中心，分离皮下组织，切取直径约为2 cm的肌肉，10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片厚4～5 μm，苏木精—伊红染色法（HE染色），显微镜下观察充血、出血、变性组织坏死、炎症细胞浸润，分别计0～3分。充血、出血：0分：无；1分：少量；2分：较多血管充血；3分：血管大片充血或灶性出血。变性坏死：0分：无；1分：局部组织变性；2分：广泛性组织变性；3分：大片组织变性。炎症细胞浸润：0分：无；1分：少量、散在的炎症细胞浸润；2分：较多、片状炎症细胞浸润；3分：大量、弥漫性炎症细胞浸润。

1.4.2 氧化应激反应 在第3、7 d给药后2 h，经腹腔注射3%戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉，经腹主动脉采集血液5 ml，采用酶联免疫吸附试验法测定超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）。

1.4.3 炎症介质检测 采血方法同氧化应激反应的采血方法，室温静置2 h，离心5 min，3 000 r/min，采用酶联免疫吸附试验法测定IL-1β、TNF-α、PGE2水平，严格按照说明书操作。

1.5 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，涉及多组间数据比较用重复方差F检验，两组间数据采用t检验；计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理损伤表现

正常对照组：肢体肌肉组织整体结构正常，肌纤维排列整齐、形态规则，无肌纤维核中移，无变性坏死，无炎症细胞浸润。模型对照组：造模3 d后，肌肉组织内肌细胞变性坏死，血管出血，间质内有大量炎症细胞浸润；造模7 d，肌细胞变性，血管出血，间质内炎症细胞浸润。三黄跌打膏组：给药3 d，肌肉组织整体结构正常，组织内少量炎症细胞浸润，组织肌纤维排列紊乱，部分肌纤维核中移，细胞核呈圆形，组织较多坏死；给药7 d，肌肉组织结构、肌纤维排列及形态基本正常，无肌纤维核中移、无坏死，组织内无明显炎症细胞浸润。狗皮膏药组：给药3 d，肌肉组织整体结构正常，组织内少量炎症细胞浸润，组织肌纤维排列紊乱；给药7 d，组织大量肌纤维崩解坏死，坏死区大量炎症细胞浸润，血管充血扩张。见图1。

图1 HE染色结果

2.2 病理组织评分

与正常对照组比较，模型对照组病理评分增加，给药组病理评分均低于模型对照组，以三黄跌倒膏组病理评分降低最明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 4组大鼠病理组织评分比较(分,±s)

表1 4组大鼠病理组织评分比较(分,±s)

注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型对照组比较，bP＜0.05；与狗皮膏药组比较，cP＜0.05

组别 例数 病理评分 正常对照组 16 0 模型对照组 3 d 8 5.85±1.08a 7 d 8 7.28±1.10a 狗皮膏药组 3 d 8 3.76±0.68ab 7 d 8 2.48±0.63ab 三黄跌倒膏组 3 d 8 2.84±0.73abc 7 d 8 1.63±0.62abc

2.3 氧化应激反应

与正常对照组比较，模型对照组氧化应激反应指标明显改变，与模型对照组比较，给药组氧化应激反应指标均有所改善，且以三黄跌打膏组改善最明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 4组大鼠氧化应激反应指标比较(±s)

表2 4组大鼠氧化应激反应指标比较(±s)

注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型对照组比较，bP＜0.05；与狗皮膏药组比较，cP＜0.05

组别 例数 SOD(U/ml) MDA(μmol/L) NO(μmol/L)正常对照组 16 54.40±2.51 3.12±1.05 9.21±1.18 模型对照组 3 d 8 40.86±1.90a 6.98±1.08a 16.38±1.21a 7 d 8 42.46±1.96a 7.15±1.12a 15.51±1.28a狗皮膏药组 3 d 8 47.20±1.32ab 5.55±1.04ab 13.35±1.18ab 7 d 8 50.86±1.35ab 6.06±1.06ab 12.42±1.21ab三黄跌打膏组 3 d 8 50.12±1.36abc 4.16±1.02abc 11.30±1.20abc 7 d 8 54.78±1.40abc 4.21±1.03abc 10.38±1.25abc

2.4 炎症介质水平

与正常对照组比较，模型对照组炎症介质水平有所提高，给药组炎症介质水平均有所降低，且以三黄跌打膏组降低最明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 4组大鼠炎症介质水平比较(ng/L,±s)

表3 4组大鼠炎症介质水平比较(ng/L,±s)

注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型对照组比较，bP＜0.05；与狗皮膏药组比较，cP＜0.05

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3 讨论

急性软组织损伤主要是因外力作用导致，其病理表现以外伤性无菌性炎症反应为主，病理可见局部组织变性坏死、血管扩张充血出血、炎症细胞浸润、组织水肿等。本研究在建立大鼠模型后，肌细胞变性，肌肉中血管出血，间质内大量炎症细胞浸润。故相应验证了急性软组织损伤的病理表现。中医学认为急性软组织损伤病机为气滞血瘀、血溢脉外、脉络不通所致，故在治疗时宜活血化瘀、通络止痛[5]。因此研究采用三黄跌打膏，大黄有活血化瘀、凉血散热、通经通络之功；黄连、黄柏有清热除湿、泻火解毒之功；制天南星有清热除湿、祛风散痰、散结消肿之功；赤小豆有利水消肿、解毒排脓之功；樟脑有行气化瘀、消肿止痛之功。诸药配伍可发挥活血祛瘀、通经止痛、消肿散结的功效，对软组织损伤有确切的治疗作用。本研究中，三黄跌打膏组、狗皮膏药组病理评分低于模型对照组，且三黄跌打膏组病理评分最低。说明膏药外敷可有效治疗急性软组织损伤，其中以三黄跌打膏治疗效果最显著。

现代医学认为急性软组织损伤后，免疫系统会在短时间内做出一过性的促炎与抑制炎症反应，大量炎症介质释放，故抑制炎症反应对改善急性软组织损伤有重要意义。同时大量致痛性炎症介质的释放，可直接导致疼痛，炎症局部肿胀会压迫神经末梢，也可引起疼痛[6]。另外炎症介质会增加静脉通透性，促使血管收缩，加重肢体缺氧缺血，影响血液流变学，增加血浆黏度，引起肢体肿胀[7]。同时氧自由基是炎症反应发生过程中的重要因子，具有强烈的趋化作用，可加重机体炎症反应。此时通过抑制氧自由基的合成及释放，可延缓炎症反应的进展，减轻炎症程度。本研究中，在大鼠模型建立后，大鼠血清炎症介质水平及氧化应激反应指标较正常对照组明显改变，但在给药后各血清因子有所改善，其中三黄跌打膏组血清IL-1β、TNF-α、PEG2、MDA、NO水平低于狗皮膏药组，SOD高于狗皮膏药组。表明当大鼠发生急性软组织损伤后，伴随明显炎症反应，血浆黏度增加，而及时给药，可显著改善肢体血液循环，减轻机体炎症反应，减弱氧化应激反应，其中三黄跌打膏作用最明显。IL-1β是促进炎症反应发生的重要介质，当机体组织受损后，IL-1β水平升高，并会诱导白细胞介素-6（IL-6）等其他促炎物质的释放，诱发炎性疼痛，形成瀑布式炎症级联反应；TNF-α是反映机体炎症反应的重要因子；PGE2是反映炎性疼痛的重要物质，当机体炎性疼痛加剧，PGE2水平明显升高[8]。SOD是清除超氧阴离子自由基的重要酶，是维持机体氧化及抗氧化平衡的重要因子；MDA是体内脂质过氧化的最终产物，可间接反映细胞损伤程度；NO是促使炎症病理进展的重要物质，并可与氧自由基等物质反应生成一种氮氧化合物，不断释放细胞毒素，造成细胞损伤。此时采用三黄跌打膏，大黄、黄连、黄柏起到抗炎、抗菌、减轻组织肿胀的作用，可有效抑制损伤组织的炎症反应，降低毛细血管通透性，抑制氧自由基的释放，快速减轻受损软组织的肿胀、疼痛程度[9-11]。

综上所述，三黄跌打膏对急性软组织损伤大鼠有显著效果，该作用可能是通过抑制氧自由基的生成，降低炎症介质水平改善急性软组织损伤程度。但该研究尚有不足，对三黄跌打膏的作用探讨仅为初步探索，由于炎症介质调控通路错综复杂，相互影响、相互制约，未探讨三黄跌打膏是通过何种通路发挥抗炎作用；而且本实验未能回答三黄跌打膏对大鼠免疫功能的影响及最优使用量、软组织损伤的免疫抑制作用，值得后续研究进一步论证。