超临界CO2流体辅助中性γ-CD-MOF载小白菊内酯工艺优化与体外释放评价

郭静雯,何远志,张永太,冯年平

(上海中医药大学中药学院,上海 201203)

小白菊内酯(Parthenolide,PTL)是一种天然倍半萜内酯,主要提取自菊科、雏菊科、木兰科植物,可从小白菊(Tanacetumparthenium)中大量提取[1]。小白菊作为传统中草药,可用于驱热、驱虫、镇痛及治疗类风湿关节炎,PTL为其主要活性成分。PTL结构中的反式α-亚甲基γ-正丁内酯环及环氧结构可与细胞特定蛋白的亲核位点结合,调节细胞生长增殖状态,为其活性位点[2-3]。近年研究表明PTL单体具有抗血管动脉粥样硬化、抗炎[4-5]、抑制肿瘤细胞增殖[2,6-8]及逆转耐药[9-10]等多种药理活性。但PTL的溶解度和稳定性均较差,限制了其作为药物的开发应用。

金属有机骨架(Metal-organic frameworks, MOF)为金属离子通过配位键作用与有机配体自组装形成的立体网状结构,具有高孔隙率及高比表面积,三维网状结构可为药物附着提供充足的空间,提高载药效率并高效递药。作为药物递送载体,MOF可增大难溶性药物的表观溶解度和溶出速率[11-12],改善药物生物利用度[13],提高药物稳定性[14],其尺寸与内部孔径的可调节性也有望实现药物的控释释放[15],是一种极具潜力的纳米载体。如以K+离子与γ-环糊精(γ-CD)自组装形成的环糊精金属有机骨架(γ-CD-MOF),具有良好的生物相容性[16]。

为除去CD-MOF网状结构中残留的反应物及有机溶剂,可采用超临界CO2流体技术(Supercritical carbon dioxide Fluid,scCO2)置换CD-MOF孔隙内杂质,最大化其载药空间[17]。scCO2具有液体的优良溶解性和气体的易扩散性[18],使用scCO2流体技术辅助PTL载入CD-MOF,可加快PTL渗透进入载体的微孔结构中,提升载药效率[19],同时避免有机溶剂使用,具有良好的安全性。

本研究以K+离子与γ-CD制备γ-CD-MOF,中性化处理得Neu-γ-CD-MOF,作为PTL的载体,改善药物的溶解性和稳定性,优化了scCO2法的载药工艺,并对载PTL的Neu-γ-CD-MOF(PTL@Neu-γ-CD-MOF)进行系统表征,评价载体的体外释药行为。

1 材料

1.1 主要仪器

超临界细微粒子装置(ZSCF-300,南通睿智超临界科技发展有限公司);高速离心机(MiniSpin plus,德国Eppendorf);台式冷冻离心机(5810R,德国Eppendorf);激光粒度仪(Nano ZS90,英国Malvern);高效液相色谱仪(1260Infinity,美国Agilent);pH高精度测试笔(PH220,乐清Cnoble公司);万分之一电子天平(BSA224S,德国Sartorius);十万分之一电子天平(BT125D,德国Sartorius);X-射线衍射仪(Smartlab 9kW,日本理学);傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet iS 5,美国Thermo);扫描电子显微镜(QUANTA FEG 250,美国FEI)。

1.2 试剂

小白菊内酯对照品(O0920AS,大连美仑生物);小白菊内酯原料药(南京春秋生物工程);无水乙醇(分析纯,G73537F,上海泰坦科技);甲醇(分析纯,G75851C,上海泰坦科技);甲醇(色谱纯,215927,赛默飞Fisher);二氯甲烷(分析纯,G81014K,上海泰坦科技);乙腈(分析纯,UN1648,德国Merck)乙腈(色谱纯,20211123,北京沃凯生物科技);聚乙二醇20000(H2130299,上海阿拉丁试剂);γ-CD(80F14,广州市泰龙生化科技);氢氧化钾(20181212,国药集团化学试剂)。

2 方法与结果

2.1 小白菊内酯含量测定

2.1.1 色谱条件 检测波长:210 nm;色谱柱:Platisil ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-超纯水(60∶40,v/v);流速:1 mL·min-1;进样量:20 μL;柱温:30 ℃;保留时间:8.2 min。

2.1.2 样品配制 ①对照品溶液:称取小白菊内酯对照品约5.00 mg,精密称定,置10 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容,摇匀得浓度约为500 μg·mL-1的储备液,备用。②待测品溶液:称取PTL@Neu-γ-CD-MOF粉末约5.00 mg,精密移取5 mL稀释液溶解,即得。③空白MOF溶液配制:称取Neu-γ-CD-MOF约5.00 mg,精密称定,精密移取5 mL稀释液溶解,得空白Neu-γ-CD-MOF溶液。④稀释液配制:水∶乙醇 1∶1(v/v)混合涡旋即得。

2.1.3 线性与范围 取适量储备液稀释配制成浓度分别为1、5、15、50、100 μg·mL-1的小白菊内酯系列对照溶液。将配制的各浓度对照溶液离心(12 000 r·min-1,10 min),吸取上清于棕色液相小瓶中,经HPLC检测,记录测得峰面积,根据峰面积(A)对小白菊内酯浓度(C)进行线性回归。

以PTL对照品浓度(C)为横坐标,对相对应的纵坐标峰面积(A)进行线性回归,回归方程A=53.305C+21.281,r=0.999 9。相关系数表明PTL在1～100 μg·mL-1的浓度范围内线性关系良好。

2.1.4 专属性与精密度 在上述色谱条件下,分别对100 μg·mL-1对照品、待测品及空白Neu-γ-CD-MOF溶液进行测定,考察分析方法的专属性。结果表示Neu-γ-CD-MOF与溶剂均不干扰PTL含量测定,表明该方法的专属性良好。

将小白菊内酯储备液加稀释液稀释得浓度为1、50、100 μg·mL-1的对照溶液,进行HPLC测定,重复进样6次,记录保留时间和峰面积并计算RSD。重复进样的样品峰面积以及保留时间的RSD值均小于3%,重复性良好,符合方法学验证要求。

2.2 γ-CD-MOF的制备与激活

2.2.1 溶剂热法制备γ-CD-MOF 以γ-CD∶KOH反应摩尔比为1∶8称量投料(γ-CD 6.48 g,KOH 2.24 g),超声溶解于200 mL纯水中,经0.45 μm滤膜滤过,滤液加入120 mL甲醇,恒温水浴50 ℃,澄清后继续加热20 min。取出后立即加入8 g·L-1的PEG2000甲醇溶液320 mL,静置过夜。反应液离心(4 000 r·min-1,5 min),弃上清,沉淀加入甲醇、无水乙醇洗涤各3次。

2.2.2 Neu-γ-CD-MOF的制备 沉淀加入醋酸5 mL,并加入无水乙醇至45 mL使之分散均匀,混悬液离心,下层沉淀加无水乙醇,洗涤3次,检测pH应为7.0±0.2,沉淀于50 ℃真空干燥箱内干燥过夜。

2.2.3 scCO2流体技术干燥激活Neu-γ-CD-MOF scCO2流体技术激活Neu-γ-CD-MOF的制备干燥前步骤同溶剂热法,用二氯甲烷(DCM)200～300 mL浸泡洗涤后的沉淀72 h,每24 h更换溶剂,浸泡后离心去上清,沉淀置于超临界细微粒子装置结晶釜中,在20 MPa压力条件,50 ℃干燥6 h。

2.3 γ-CD-MOF理化性质表征

2.3.1 粒径分布 以甲醇分散γ-CD-MOF,配制成5 g·L-1混悬液,超声10 min分散均匀,室温(25 ℃)条件下,采用马尔文激光粒度仪测定粒径。

2.3.2 扫描电镜观察 将γ-CD-MOF均匀地涂布于导电胶表面,对样品进行喷金处理,制样后用扫描电子显微镜对样品进行观察分析,在适当的放大倍数下观察样品的形态。

2.4 PTL@Neu-γ-CD-MOF的制备及载药条件优化

2.4.1 溶剂孵育法 分别称取0.06、0.10、0.12 g小白菊内酯原料药溶解于2 mL无水乙醇中,得30、50、60 g·L-1药物溶液,待药物溶解后加入0.06 g Neu-γ-CD-MOF,置于磁力搅拌装置水浴加热50 ℃,转速50 r·min-1条件下搅拌2 h,离心(12 000 r·min-1,10 min),沉淀置于烘箱中50 ℃干燥3 h,。采用HPLC法测定小白菊内酯含量,计算载药量。

2.4.2 scCO2技术辅助Neu-γ-CD-MOF载药 称取0.30 g的PTL原料药溶解于10 mL无水乙醇后置于超临界细微粒子装置结晶釜内,加入scCO2干燥激活的0.60 g Neu-γ-CD-MOF,在20 MPa,50 ℃条件下载药2 h,离心(12 000 r·min-1,10 min),沉淀置于烘箱中50 ℃干燥3 h。采用HPLC法测定小白菊内酯含量,计算载药量。

2.4.3 γ-CD包合物制备 采用饱和水溶液沉淀法制备PTL@γ-CD包合物。配制0.17 mol·L-1(近饱和)的γ-CD水溶液10 mL,将0.42 g PTL溶于少量无水乙醇中,缓慢滴入到γ-CD水溶液中,50 ℃水浴加热,搅拌转速为300 r·min-1,包合6 h后室温放冷,置于4 ℃冰箱,沉淀析出,抽滤,用无水乙醇滴加洗涤滤饼3次,将滤饼放入50 ℃烘箱干燥即得。

2.4.4 PTL载药量测定 精密称取5.00 mg载药样品于10 mL容量瓶中,加入稀释液溶解并定容,稀释适当倍数使之浓度在标准曲线范围内,经HPLC法测定,记录测得峰面积。样品总质量记为W总,样品中测得PTL的质量记为WS,载药量=WS/W总×100%。

2.5 PTL@Neu-γ-CD-MOF理化性质表征

2.5.1 粉末X射线衍射 取一定量粉末平铺于载玻片上进行CuKα靶衍射,仪器的管电压与电流分别为40 kV,40 mA,扫描的角度范围是340°,扫描的步长为0.02°,扫描的速度设置为每步0.1 s。

2.5.2 傅里叶红外光谱 将样品与溴化钾按照1∶10(w/w)的比例混合,研磨成均匀粉状,取适量于压片器中进行压片,测定样品在波数为4 000～400 cm-1范围内的红外吸收光谱。

2.6 表观溶解度

分别称取过量PTL原料药以及PTL@Neu-γ-CD-MOF、PTL@γ-CD样品,加入2 mL超纯水使之达到过饱和状态,固定于气浴摇床中,设置温度为25 ℃,转速100 r·min-1条件下振荡72 h后取上清液过0.22 μm滤膜,滤液经稀释后用HPLC法测定PTL浓度,计算表观溶解度。

2.7 体外释放评价

2.7.1 溶出方法 裁剪透析袋(截留分子量8 000～14 000)至合适长度,置于500 mL含NaHCO310.00 g、EDTA 146.12 mg煮沸15 min,清洗干净,置干净去离子水中保存。根据载药量精密称取11.32 mg PTL@Neu-γ-CD-MOF、23.23 mg PTL@γ-CD、3.00 mg PTL原料药置预先加入1 mL溶出介质的透析袋中,装入含释放介质30 mL的离心管中,置气浴摇床,100 r·min-1,(37±0.5) ℃,于溶出开始后的0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24 h分别吸取2 mL(同时加入2 mL相同温度的溶出介质),经0.45 μm滤膜滤过,采用HPLC法测定PTL浓度。绘制溶出曲线。

2.7.2 溶出介质 pH 7.4磷酸盐缓冲液:取PBS磷酸盐缓冲剂(含NaCl,Na2HPO4·12H2O,NaH2PO4·H2O),加去离子水溶解为1 000 mL。

3 结果

3.1 粒径分布

粒径及多分散系数值(PDI)见于表1。相比于二氯甲烷激活,scCO2激活所得γ-CD-MOF PDI更小,分散更均一。二氯甲烷活化γ-CD-MOF经中性化处理组(二氯甲烷激活Neu-γ-CD-MOF)粒径比未中性化组(二氯甲烷激活γ-CD-MOF)增大近1倍,而scCO2激活γ-CD-MOF经中性化处理组(scCO2激活Neu-γ-CD-MOF)的粒径比未中性化处理组(scCO2激活γ-CD-MOF)仅增加18.24%,提示采用scCO2活化有助于γ-CD-MOF晶体的分散和稳定。

表1 不同干燥方式制备γ-CD-MOF的粒径Table 1 Mean size of γ-CD-MOF prepared by different drying methods

3.2 扫描电镜观察

二氯甲烷激活与scCO2激活γ-CD-MOF的晶体均呈均一的立方体(图1),与马尔文粒径仪测得结果相符,表明超临界反应釜内20 MPa的高压环境对其形态无影响,且scCO2激活γ-CD-MOF聚集成团块的情况较轻,以马尔文粒径仪测得其PDI值明显小于二氯甲烷激活组(表1),提示scCO2激活γ-CD-MOF的粒径分布更均匀。

注：A.二氯甲烷激活Neu-γ-CD-MOF;B.scCO2激活Neu-γ-CD-MOF

3.3 Neu-γ-CD-MOF的制备及载药条件优化

3.3.1 载药浓度考察 对Neu-γ-CD-MOF进行不同载药浓度的载药考察(50 ℃,2 h)，见表2,在常规载药方法中,载药浓度提高能增加载药量,但达到一定载药浓度后载药量提升并不显著,可能与载药接近饱和有关。

表2 载药浓度考察Table 2 Drug loading of Neu-γ-CD-MOF processed

3.3.2 scCO2技术辅助Neu-γ-CD-MOF载药 载药浓度相同(50 g·L-1)时,使用scCO2技术干燥激活制备的Neu-γ-CD-MOF与溶剂浸泡激活的Neu-γ-CD-MOF相比具有更高的载药能力,scCO2辅助Neu-γ-CD-MOF载PTL的载药量可以达到(26.58±0.43)%,显著高于常规载药以及环糊精包合(表3)。

表3 不同干燥方式制备Neu-γ-CD-MOF的载药量Table 3 Drug loading of Neu-γ-CD-MOF processed

3.4 PTL@Neu-γ-CD-MOF纳米粒理化性质表征

3.4.1 粉末X射线衍射 粉末X射线衍射图谱(图2)可以看出,二氯甲烷激活Neu-γ-CD-MOF在4.1°、5.8°、7.1°、13.5°以及16.8°处有显著的衍射峰,scCO2激活Neu-γ-CD-MOF也同样具有上述衍射峰,且其在13.5°以及16.8°处的衍射峰显著增强。说明scCO2激活Neu-γ-CD-MOF的晶体结构稳定且结晶性更好。

图2 Neu-γ-CD-MOF激活前/后和scCO2载药后XRD衍射图谱Fig.2 XRD of PTL, Neu-γ-CD-MOF, scCO2 actived Neu-γ-CD-MOF, and PTL@Neu-γ-CD-MOF

PTL原料药以稳定的晶型存在,在9.6°、15.3°、17.14°以及19.1°有显著的衍射峰,而载药后PTL@Neu-γ-CD-MOF中PTL特征衍射峰消失,提示PTL以非晶态形式存在于Neu-γ-CD-MOF中,超临界载药后Neu-γ-CD-MOF的特征衍射峰依然存在,说明载药过程中Neu-γ-CD-MOF结构稳定。

3.4.2 傅里叶红外光谱 傅里叶红外光谱(图3)表明PTL在1 754 cm-1和1 655 cm-1处具有特征红外振动吸收,为PTL的不饱和羰基v(C=O)的伸缩振动,经scCO2辅助载药后PTL的特征红外吸收峰完全消失,说明PTL成功包载于Neu-γ-CD-MOF空腔内导致其特征伸缩振动消失;而Neu-γ-CD-MOF载药后其特征吸收依然存在,说明在超临界载药过程中Neu-γ-CD-MOF结构稳定。

图3 Neu-γ-CD-MOF、PTL以及PTL@Neu-γ-CD-MOF的FT-IR光谱Fig.3 FT-IR spectra of Neu-γ-CD-MOF, PTL,and PTL@Neu-γ-CD-MOF

3.5 表观溶解度

表观溶解度结果(表4)表明Neu-γ-CD-MOF对PTL具有增溶作用,其在水中的表观溶解度比原料药提高2.2倍;γ-CD包合物在水中对PTL原料药仅增溶1.5倍。

表4 PTL原料药、PTL@γ-CD及PTL@Neu-γ-CD-MOF在水中的平衡溶解度Table 4 Solubility of PTL, PTL@γ-CD,and PTL@CD-MOF in water

3.6 体外释放评价

溶出曲线(图4)显示PTL@Neu-γ-CD-MOF纳米粒在0.5 h释放了24.93%,而原料药组仅释放了4.69%,表明纳米载体显著提高了PTL的释放速率。24 h内PTL@Neu-γ-CD-MOF组药物的累积释放度可达98.32%,PTL@γ-CD组累积释放77.58%,而PTL原料药组仅释放44.80%。以上结果显示,PTL@Neu-γ-CD-MOF比PTL@γ-CD和PTL具有更快的药物溶出速率和更高的累积释放度。

图4 PTL@Neu-γ-CD-MOF、PTL@γ-CD、PTL在PBS中的溶出曲线Fig.4 In vitro dissolution curves of PTL@Neu-γ-CD-MOF,PTL@γ-CD, and PTL in PBS

4 讨论

本研究利用scCO2流体技术激活γ-CD-MOF,并优化其载药工艺。使用中性化γ-CD-MOF为载体,可避免PTL受碱性MOF影响而降解。以载药量为评价指标对比了溶剂孵育法以及scCO2流体辅助法制备的PTL@Neu-γ-CD-MOF,scCO2流体辅助Neu-γ-CD-MOF载PTL的载药量可以达到26.58±0.23%,显著高于常规载药以及环糊精包合物,显示scCO2流体技术可利用其高溶解度及高扩散性加速PTL进入Neu-γ-CD-MOF的载药微孔中。

采用扫描电镜对scCO2激活前后的γ-CD-MOF进行表征,结果显示采用scCO2流体技术激活更易得到单分散的γ-CD-MOF晶体,比溶剂激活法更高效且绿色无有机溶剂残留,具有良好的生物相容性。FT-IR和PXRD图谱中,PTL特征吸收峰与指示晶型的特征衍射峰在载入Neu-γ-CD-MOF后消失,表明PTL以非晶态存在于Neu-γ-CD-MOF中,同时载药前后Neu-γ-CD-MOF晶型结构无显著变化,说明载药过程不影响Neu-γ-CD-MOF的晶型,载药后仍能保持完整的晶体结构。

PTL原料药在水中饱和溶解度为(549.02±0.69)μg·mL-1,以非晶态载入Neu-γ-CD-MOF,可解除PTL晶格能的束缚,同时MOF与PTL药物形成包合物或纳米团簇,对PTL具有一定的增溶作用,其在水中的表观溶解度比原料药提高2.2倍。体外释放评价显示PTL@CD-MOF纳米粒溶出特征明显优于PTL@γ-CD及PTL原料药。环糊精包合物可通过药物PTL与环糊精之间形成络合物,增强氢键作用而增溶,而Neu-γ-CD-MOF增溶机制为PTL药物分子既可在Neu-γ-CD-MOF的双环糊精分子中形成PTL的环糊精包合物,又可在γ-CD-MOF的空腔内形成药物纳米团簇,凸显了Neu-γ-CD-MOF的递药优势。