真核基因组编码大量长链非编码RNA癌易感性候选基因15在肺癌细胞中表达上调且通过miR-153-3p激活Wnt/β-catenin通路调控A549细胞增殖、侵袭及化疗敏感性实验研究

2022-07-12 14:01轲,李
陕西医学杂志 2022年7期
关键词:荧光素酶靶向活力

贺 轲,李 凯

(1.广东省第二人民医院普外一科,广东 广州510317;2.西安市第三医院心血管外科,陕西 西安710032)

肺癌包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌,是全球最常见的癌症相关死亡原因,5年生存率约为16.6%[1-2]。然而,多种已知致癌物的存在以及不同的遗传背景,使得肺癌的发生发展中致癌因素变得难以确定。因此,研究其潜在的致病机制和更准确的预测生物标志物是十分必要的。真核基因组编码大量长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是指长度超过200个核苷酸的内源性细胞RNA,但缺乏显著长度的开放阅读框[3]。虽然大多数lncRNA的功能尚不清楚,但其数量的增加以及参与许多生物学过程的证据的积累,为lncRNA的失调与恶性细胞中的癌症发展、侵袭和转移提供了令人信服的论据[4-5]。例如lncRNA PVT1通过激活KAT2A乙酰转移酶和稳定HIF-1α调控鼻咽癌细胞增殖[6]。Chen等[7]发现CCAT2预测小细胞肺癌的不良预后并调节生长和转移。还发现TCF-4调控的lncRNA-XIST促进巨噬细胞M2极化,与肺癌相关[8]。lncRNA 癌易感性候选基因15(Cancer susceptibility candidate 15,CASC15)是一种新发现的致癌基因,例如早期发现的口腔鳞癌患者血浆lncRNA CACS15上调[9]。lncRNA CACS15通过海绵miR-145正向调控ABCC1参与结直肠癌奥沙利铂耐药[10]。有文献报道lncRNA CASC15通过靶向miR-200a-3p促进前列腺癌的迁移和侵袭[11]。这些结果表明,lncRNA CASC15在恶性肿瘤的发生发展进程中起着重要作用。然而,lncRNA CASC15与肺癌进展之间的相互作用尚不明了。因此,lncRNA CASC15在肺癌中的作用及其机制仍有待确定。我们在本实验中主要通过探讨lncRNA CASC15对肺癌A549细胞增殖、侵袭和化疗敏感性的影响,进一步深入了解肺癌的发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 65例肺癌组织与50例癌旁组织纳入本研究,手术中切除了肺癌组织,并在-80 ℃的液氮中保存。所有的参与者都同意实验方案和计划,该项目经过了本医院伦理委员会批准。肺癌A549细胞和正常肺上皮BEAS-2B细胞有中国科学院上海细胞库提供。DMEM培养基、由美国Gibco公司提供。FBS来自美国Clarkbio公司。ECL蛋白发光试剂盒来自美国Pierce公司。RIPA裂解液购自上海碧云天生物科技有限公司。miR-153-3p抑制剂(miR-153-3p inhibitor)、miR-153-3p模拟物(miR-153-3p mimics)来自Genepharma公司。CASC15 siRNA、pcDNA-CASC15质粒来自上海生工有限公司。凋亡检测试剂盒来自美国BD公司。顺式-二氯二氨合铂(批号:9712055)。

1.2 实验方法

1.2.1 A549和BEAS-2B细胞培养: 参与本研究的肺癌A549细胞和正常肺上皮BEAS-2B细胞置于DMEM 中添加10%胎牛血清培养。培养的细胞在常规条件下(37 ℃、5% CO2和饱和湿度)条件下生长。

1.2.2 细胞转染:生物公司根据基因的目标序列设计合成重组质粒后,将转染组分为:①siRNA NC、CASC15 siRNA组;②Control、XAV939组;③inhibitor NC、miR-153-3p inhibitor、miR-153-3p inhibitor+XAV939组;④pcDNA-3.1(+)+mimics NC、pcDNA-CASC15+mimics NC、pcDNA-3.1(+)+miR-153-3p mimics、pcDNA-CASC15+miR-153-3p mimics组。按照Lipofectamine 2000的方法质粒共转染A549细胞,12 h更换新鲜培养基。采用RT-qPCR检测转染效率。

1.2.3 细胞增殖能力测定:转染后第2天后进行细胞增殖试验,另外96孔板中的转染完成的A549细胞在培养箱中孵育12 h后用不同浓度顺铂(0、2、4、8、16 μg/ml)处理细胞,48 h后加入10 μl/孔CCK-8试剂,在培养箱中继续孵育4 h。用酶标仪在450 nm处测定吸光度OD值。试验重复了3次,然后记录并分析数据,制作细胞增殖图。

1.2.4 双荧光素酶报告基因活性检测:基于lncRNA CASC15的全序列,利用miRcode生物信息学网站分析预测可能针对CASC15的miRNAs。CASC15野生型(WT)的非翻译区、包含miR-153-3p的潜在结合位点以及CASC15突变的相应3’非翻译区被克隆到psiCheck2双荧光素酶报告基因中。A459细胞用含有3’非翻译区报告基因瞬时转染,并使用双荧光素酶报告基因检测系统在荧光素酶活性后48 h报告miR-153-3p模拟物和阴性对照的转录。双荧光素酶检测进行以确认miR-153-3p和CASC15的靶标关系。

1.2.5 细胞侵袭实验: Transwell法检测细胞侵袭情况。简单的步骤如下:转染24 h后,将细胞消化重悬于无胎牛血清和双抗体的培养基中。稀释Matrigel 基质后将200 μl加入Transwell上室,12 h后在上层加入细胞悬液200 μl,24孔板下层加入含血清培养基500 μl。继续培养24 h后,取出小室,弃去培养基,每个室加500 μl PBS洗2次,室温甲醇固定60 min。然后擦拭滤片表面的细胞,用结晶紫染色30 min。然后在显微镜下观察细胞并拍照。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率: A549细胞转染成功后用16 μg/ml顺铂处理细胞,第2天后用0.25%胰酶消化并收集细胞,用流式缓冲液重悬细胞,每孔细胞和5 μl Annexin V-APC孵育30 min,再与5 μl PI一起孵育5 min,最后检测细胞凋亡率。

1.2.7 实时定量PCR (RT-qPCR): RNA提取和定量实时聚合酶链反应试验按步骤进行。用Trizol从细胞和组织中提取总RNA,测定浓度后用引物逆转录试剂盒合成cDNA。用SYBR Green染料进行定量实时聚合酶链反应分析。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用作基因表达的标准化对照。结果通过2-△△Ct法分析。所用的引物见表1。

表1 引物序列

1.2.8 Western blot: 用RIPA裂解缓冲液从细胞和组织中提取蛋白质,并用BCA试剂盒进行定量。将蛋白质样品进行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,并转移到聚偏氟乙烯膜上。β-catenin、CyclinD1和 c-myc蛋白抗体用于孵育膜。第2天,膜与二级抗体一起孵育,最后取PVDF膜进行蛋白显影。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0统计学软件进行分析,绘图软件采用Graphpad Prism 5。统计值以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 RT-qPCR检测CASC15表达及沉默CASC15影响A549细胞增殖、侵袭及化疗敏感性 由RT-qPCR结果可知,肺癌组织、癌旁正常组织、A549和BEAS-2B细胞中CASC15基因表达分别为(2.56±1.04)、(1.02±0.34)、(1.98±1.02)、(0.96±0.05),结果说明CASC15在肺癌组织和A549细胞中表达上调(P<0.01)。CASC15 siRNA组A549细胞内CASC15基因表达(0.32±0.78)显著低于siRNA NC组(1.14±0.54,P<0.01)。分析图1结果可知,和siRNA NC组相比,CASC15 siRNA转染A549细胞48 h后增殖活力显著降低(P<0.01),CASC15 siRNA转染组A549细胞侵袭数目明显减少(P<0.01)。而用不同浓度顺铂(0、2、4、8、16 μg/ml)作用细胞后,下调CASC15明显降低细胞增殖活力,使细胞凋亡率明显上升(P<0.01)。

A:沉默lncRNA CASC15表达后利用CCK-8法测定A549细胞增殖活力;B:沉默lncRNA CASC15表达后利用Transwell测定A549细胞侵袭数目;C:A549细胞侵袭数目;D:不同浓度顺铂处理细胞,利用CCK-8法分析沉默CASC15表达后A549细胞增殖活力;E:16 μg/ml顺铂处理细胞并沉默CASC15表达,流式细胞仪检测A549细胞凋亡率的;F:A549细胞凋亡率。组间比较,*P<0.05

2.2 lncRNA CASC15靶向miR-153-3p 图2A为miRcode预测的CASC15和miR-153-3p之间的结合位点。由图2B结果可知,和mimics NC+CASC15 wt组相比,CASC15 wt+miR-153-3p mimics组细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.01),和mimics NC+CASC15 mut组相比,CASC15 mut+miR-153-3p mimics组细胞的荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)。

A:软件预测lncRNA CASC15与miR-153-3p之间的靶向结合点;B:双荧光素酶报告基因检测lncRNA CASC15与miR-153-3p之间的相关性,*P<0.05

2.3 RT-qPCR检测miR-153-3p表达及沉默miR-153-3p影响A549细胞增殖、侵袭及化疗敏感性 由RT-qPCR结果可知,肺癌组织、癌旁正常组织、A549和BEAS-2B细胞中miR-153-3p基因表达分别为(0.65±0.98)、(1.24±0.52)、(0.76±1.16)、(1.76±0.42),结果说明miR-153-3p在肺癌组织和A549细胞中表达下调(P<0.01)。miR-153-3p inhibitor组A549细胞内miR-153-3p基因表达(0.39±0.72)显著低于siRNA NC组(1.07±0.62,P<0.01)。分析图3结果可知,和inhibitor NC组相比,miR-153-3p inhibitor转染A549细胞48 h后增殖活力显著上调(P<0.01),miR-153-3p inhibitor转染组A549细胞侵袭数目明显增加(P<0.01)。而用不同浓度顺铂(0、2、4、8和16 μg/ml)作用细胞后,下调miR-153-3p 明显升高了细胞增殖活力,使细胞凋亡率明显降低(P<0.01)。

2.4 lncRNA CASC15通过miR-153-3p影响A549细胞增殖、侵袭及化疗敏感性 由图4A-C 结果可知,与pcDNA-3.1(+)+mimics NC组对比,pcDNA-CASC15+mimics NC组A549细胞活力和侵袭数目显著上调(P<0.01),pcDNA-3.1(+)+miR-153-3p mimics组细胞活力和侵袭数目明显降低(P<0.01),pcDNA-CASC15+miR-153-3p mimics组细胞活力和侵袭数目明显高于pcDNA-3.1(+)+miR-153-3p mimics组(均P<0.01)。由图4D-F结果可知,16 μg/ml顺铂作用细胞后,与pcDNA-3.1(+)+mimics NC组对比,pcDNA-CASC15+mimics NC组A549细胞活力显著上调(P<0.01),细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。pcDNA-3.1(+)+miR-153-3p mimics组细胞活力明显降低(P<0.01),细胞凋亡率显著上升(P<0.01)。和pcDNA-3.1(+)+miR-153-3p mimics组相比,pcDNA-CASC15+miR-153-3p mimics组A549细胞活力显著上调(P<0.05),细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。

2.5 过表达及沉默miR-153-3p对A649细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响 由图5A-B 结果可知,和inhibitor NC组相比,miR-153-3p inhibitor转染A549细胞后胞内β-catenin/GAPDH、CyclinD1/GAPDH和c-myc/GAPDH比值升高(P<0.01);和mimics NC组相比,miR-153-3p mimics组细胞内β-catenin/GAPDH、CyclinD1/GAPDH和c-myc/GAPDH比值降低(P<0.01)。表明沉默miR-153-3p激活了A649细胞Wnt/β-catenin信号通路。

A:Western blot检测过表达及沉默miR-153-3p对A549细胞内CyclinD1、β-catenin、c-myc表达的影响;B:相对蛋白表达水平,组间比较,*P<0.05

2.6 miR-153-3p通过Wnt/β-catenin信号通路影响A549细胞增殖、侵袭及化疗敏感性 分析图6结果可知,和inhibitor NC组相比,miR-153-3p inhibitor转染A549细胞48 h后增殖活力显著上调(P<0.01),细胞侵袭数目明显增加(P<0.01)。16 μg/ml顺铂作用细胞后,miR-153-3p inhibitor明显升高了细胞增殖活力(P<0.05),降低了细胞凋亡率(P<0.01)。和miR-153-3p inhibitor组相比,miR-153-3p inhibitor+XAV939组细胞增殖活力显著降低(P<0.01),细胞侵袭数目明显减少(P<0.01),16 μg/ml顺铂作用细胞后,miR-153-3p inhibitor+XAV939明显降低了细胞增殖活力(P<0.05),提高了细胞凋亡率(P<0.01)。

A:miR-153-3p通过Wnt/β-catenin信号通路对A549细胞增殖活力的影响;B:miR-153-3p通过Wnt/β-catenin信号通路对A549细胞侵袭的影响;C:A549细胞侵袭数目;D:16 μg/ml顺铂处理细胞后miR-153-3p通过Wnt/β-catenin信号通路对A549细胞增殖活力的影响;E:16 μg/ml顺铂处理细胞后miR-153-3p通过Wnt/β-catenin信号通路对A549细胞凋亡率的影响;F:A549细胞凋亡率。组间比较,*P<0.05

3 讨 论

新出现的证据证明,失调的lncRNAs在调节生物过程中具有重要作用,如细胞增殖、侵袭和凋亡等生物学进程。对于肺癌的肿瘤发生机制,已有大量关于其增殖、侵袭、转移的分子研究[12]。如Jiang等[13]研究发现lncRNA HOTAIR通过上调miR-613影响非小细胞肺癌的发生和转移。有研究表明lncRNA-MALAT1通过STAT3激活上调MRP1和MDR1,参与肺癌顺铂耐药[14]。综合所述,lncRNA可能在肺癌的肿瘤进展过程中发挥重要调控作用。CASC15作为一个非常重要的lncRNA,在人类疾病中,如贲门舌鳞癌进展、肥大和肝细胞癌,已被确定为致癌RNA[15],在本研究中,我们发现lncRNA CASC15在肺癌细胞和组织中显著增加,我们的结果与之前的研究结果一致,表明CASC15在癌细胞中均处于表达上调趋势。分析CASC15在癌细胞中的差异表达与其发挥的生物学功能,我们猜想CASC15也可能在A549细胞发展中发挥促癌作用。

仅探明lncRNA CASC15在肺癌恶性行为中的作用是不够的,因此,我们进一步研究了CASC15调控肺癌肿瘤发生的深层次机制。lncRNA最重要的分子机制之一是其作为ceRNA海绵化miRNA的作用。我们发现通过生物信息学在线工具预测lncRNA CASC15的下游靶点miR-153-3p,然后通过荧光素酶报告基因检测进行了确认,很明显lncRNA CASC15可以作为miR-153-3p海绵,这一结果为我们的猜想提供了有力的支持。RT-qPCR结果表明miR-153-3p在肺癌细胞和组织中表达是下调的。有文献报道miR-153-3p在乳腺癌细胞中表达下调,靶向下调Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶1(Rho-associated coiled coil-forming protein kinase 1,ROCK1)基因抑制乳腺癌细胞增殖及迁移。miR-153-3p通过靶向MCL1基因调控卵巢癌的体内外进展[16]。miR-153-3p通过抑制E3F3表达抑制甲状腺癌细胞增殖、侵袭和糖酵解[17]。另外还发现miR-153-3p在复发OS组织、MG63/DDP、U2OS/DDP细胞中明显降低。我们参照miR-153-3p在其他癌症中发挥的功能,猜想miR-153-3p可能在肺癌中也是具有抑癌作用。在接下来的生物学功能验证中发现了沉默miR-153-3p促进了肺癌A549细胞的增殖和侵袭,下调了A549细胞对顺铂的化疗敏感性。且lncRNA CASC15靶向miR-153-3p对A549细胞发展及其化疗敏感性具有调控作用。因此,我们发现了lncRNA CASC15/miR-153-3p反馈回路在肺癌发展中的重要作用。Wnt/β-连环蛋白信号通路是控制胚胎发育的重要途径。β-连环蛋白向细胞核的转移诱导大量转录因子的激活,进一步调节下游信号级联。先前的研究已经确定了Wnt/β-连环蛋白信号通路参与了如前列腺癌、肺癌、结直肠癌和乳腺癌等各组癌症的发展及其他生物学进程[18-20]。我们发现miR-153-3p的下调显著激活了Wnt/β-连环蛋白信号通路,抑制通路后,miR-153-3p对肺癌细胞发展的调控作用也明显下调。在本研究中我们发现了一个新的调控通路lncRNA CASC15/miR-153-3p/Wnt/β-catenin对于A549细胞的增殖、侵袭和化疗敏感性至关重要,然而该通路是否在其他肺癌细胞系中发挥同样的生物学作用尚不清楚,此外在其他肺癌细胞中,lncRNA CASC15是否是靶向其他miRNA发挥促癌作用也不明了,这也是文章的不足之处,需要进一步深入研究和探讨。

在本研究中,我们发现了lncRNA CASC15在肺癌肿瘤发生过程中的重要调控作用,通过靶向miR-153-3p激活Wnt/β-catenin通路参与了肺癌细胞的恶性行为,研究结果揭示了调控肺癌发展的新通路,值得深入研究。

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