MiR-506-3p与自噬相关因子在烧伤后皮肤成纤维细胞中的表达研究

史敏 丁欣强 郭晓波 陈炜荧 张明雨

[摘要]目的：分析燒伤组织中miR-506-3p的表达及其对自噬水平的调控。方法：提取正常皮肤组织、烧伤皮肤组织和热处理成纤维细胞细胞的总RNA，采用荧光定量RT-qPCR、Western Blot分别检测各细胞miR-506-3p和自噬相关因子（LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、p62及CollagenⅠ）表达水平;采用同样方法检测miR-506-3p模拟物或miR-506-3p抑制剂转染到真皮成纤维细胞中对上述自噬相关因子表达水平的影响，并利用CCK-8方法检测转染细胞的增殖效率。结果：与正常组织相比，烧伤组织和热处理成纤维细胞中，miR-506-3p的表达下调，自噬相关因子LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5及Collagen Ⅰ的表达显著上调（P<0.01），而p62表达下调（P<0.05）;miR-506-3p抑制剂转染到皮肤成纤维细胞中，miR-506-3p表达显著降低，促进了细胞增殖和自噬发生，而miR-506-3p的过表达则显示出相反的作用（P<0.05）。结论：miR-506-3p在烧伤皮肤组织恢复中发挥着积极作用，对调节成纤维细胞的自噬水平具有重要作用，有可能成为烧伤愈合后瘢痕潜在治疗的靶标。

[关键词]热损伤;真皮成纤维细胞;微小RNA;自噬;瘢痕形成

[中图分类号]R334+.5    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2022）05-0086-04

Expression of MiR-506-3p and Autophagy-related Factors in Post-burn Skin Fibroblasts

SHI Min1，DING Xinqiang2，GUO Xiaobo3，CHEN Weiying1，ZHANG Mingyu1

（1.School of Medicine，Xi’an Peihua University，Xi’an 710125，Shaanxi，China; 2.Department of Dermatology，Xi'an Children's Hospital，Xi’an 710003，Shaanxi，China; 3.Clinical Laboratory，Xi’an Central Hospital，Xi’an 710003，Shaanxi，China）

Abstract： Objective To analyze the expression of miR-506-3p in post-burn tissues and its regulation of autophagy. Methods To extract the total RNA of normal skin tissue， burned tissue and heat treatment into fibroblast cells， using fluorescent quantitative RT-QPCR， Western Blot， respectively， detects mIR-506-3p and autophagy-related factors（LC3-II/I ratio， Atg5， p62 and Collagen I） in post-burn tissue and heat-damaged skin fibroblasts， RT-qPCR was also used to detect the effect of miR-506-3p mimic or miR-506-3p inhibitor transfected into dermal fibroblasts on the expression of autophagy-related factors， and CCK-8 method was used to detect the proliferation efficiency of transfected cells. Results Compared with normal tissues， in post-burn tissues and heat-treated fibroblasts， the expression of miR-506-3p was down-regulated， and the expression of autophagy-related factors， such as LC3-II/I ratio， Atg5 and Collagen I， were significantly up-regulated， while the expression of p62 was down-regulated. When miR-506-3p inhibitors were transfected into dermal fibroblasts， the expression of miR-506-3p was significantly down-regulated， which could promote cell proliferation and autophagy， while the overexpression of miR-506-3p showed the opposite effect. Conclusion MiR-506-3p plays an positive role in the recovery of post-burn skin， and plays an important role in regulating the autophagy level of fibroblasts，it may be a potential target for post-burn scar treatment.

Key words： thermal damage; dermal fibroblasts; micro-RNA; autophagy; scar formation

皮肤在烧伤后的修复过程中有多种类型的细胞参与，其中最重要的是真皮成纤维细胞，其通过分泌多种细胞因子促进细胞增殖、迁移和细胞外基质的产生[1]，其中微小RNA（miRNA）参与细胞自噬的调节并影响着人增生性瘢痕的形成[2]。此外，研究表明自噬与病理性瘢痕等纤维化疾病密切相关，miRNA在多个自噬通路中扮演着关键角色，如在肾脏缺血再灌注损伤时miR-21可抑制細胞自噬，促进肾脏纤维化和胶原的合成，给予miR-21抑制剂可增加自噬因子LC3Ⅱ和Beclin-1的表达，减轻肾纤维化损伤[3]。本课题组前期研究证实了miR-21通过调节人瘢痕成纤维细胞中PTEN的表达影响成纤维细胞增殖[4]。本次研究拟探讨瘢痕形成中miR-506-3p表达及对自噬相关因子LC3、Atg5、p62及CollagenⅠ的调控机制，现报道如下。

1  材料和方法

1.1 标本收集：收集2018年4月-2019年5月在西安市儿童医院皮肤科就诊的30例烧伤患者烧伤后24 h内的皮肤样本，烧伤深度为Ⅱ度或Ⅲ度，将每例患者的烧伤皮肤组织和邻近正常对照皮肤组织标本储存于–80℃液氮中，以备研究。样本取材前征得患者本人或家属知情同意，所有实验操作均经医院伦理委员会批准。患者术前1年内未接受任何相关药物治疗，且无肿瘤病史。

1.2 实验试剂：人皮肤成纤维细胞系HSAS4和人胚肾293T（HEK293T）细胞源自空军军医大学;DMEM培养基、青霉素和链霉素购自HyClone公司;miR-506-3p模拟物、miR-506-3p抑制剂和相应的阴性对照购自RiboBio公司;基因过表达载体（Ad-Beclin-1）和对照载体购自GenScript Biotech公司;PrimeScript RT试剂盒和Mir-XTM miRNA第一链合成试剂盒购自大连塔卡拉生物科技有限公司;SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒、SYBR PrimeScript™ miRNA RT-PCT试剂盒及7900HT实时PCR系统购自美国Biosystems公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养、热处理模型构建和转染：将HSAS4和HEK293T细胞在37℃ 5%CO2环境下培养，10%胎牛血清DMEM为含100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的抗生素混合物。将HSAS4细胞培养物放入热水器槽中，在52℃下孵育30 s，然后在正常条件下孵育，建立细胞热处理模型，以模拟烧伤状态。将热处理后的HSAS4细胞以104个/孔的密度接种到六孔板中，根据说明书采用Lipofectamine 2 000质粒瞬时转染细胞。MiR-506-3p模拟物、miR-506-3p抑制剂和相应的阴性对照（NC模拟物和NC抑制剂）分别转染至HSAS4细胞，24 h后更换培养基。

1.3.2 RNA提取和RT-qPCR分析：用Trizol试剂分别提取正常皮肤组织、烧伤皮肤组织和转染后HSAS4细胞的总RNA。反转录按照Prime Script RT试剂盒和Mir-XTM miRNA第一链合成试剂盒说明书进行操作。将反转录产物通过7900HT RT-PCR系统来测量mRNA和miRNA的12 h、24 h、48 h的表达水平，并进行比较。基因特异性引物选用miR-506-3p和β肌动蛋白。独立操作至少重复3遍，使用相对定量2-ΔΔCT方法分析数据。

1.3.3 CCK-8细胞增殖检测：CCK-8方法检测转染48 h后的HSAS4细胞增殖效率，利用微孔板在0 h、24 h和72 h分别读取细胞增殖效率。以1.0×105个细胞/孔的密度将转染的细胞接种于六孔板，并将100μl无FBS的培养基和8μl CCK-8添加至每孔中，于黑暗中孵育2 h。之后在每个特定的时间点（0 h、24 h和72 h）通过测量吸光度（450 nm）检测细胞增殖水平。此过程重复3遍以上。

1.3.4 Western Blot检测：将RIPA裂解缓冲液分别从正常组织、烧伤后皮肤组织和转染的HSAS4细胞中获得总蛋白裂解物，再用BCA试剂盒检测蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳分离样品蛋白并转膜。用5%脱脂牛奶封闭1 h，随后将膜和以下第一抗体分别在4℃下过夜孵育：LC3B（1︰300），p62（1︰400），Atg5（1︰300），LH2（1︰500）和CollagenⅠ（1︰800）。β肌动蛋白被设置为内源性对照物。最后将膜与第二抗体IgG再在室温下孵育2 h。显影曝光后，用ECL-Plus Western Blot系统分析靶基因的相对表达水平。所有实验重复3遍以上。

1.4 观察指标：采用荧光定量RT-qPCR、Western Blot检测正常皮肤组织、烧伤组织和热损伤HSAS4细胞、正常皮肤成纤维细胞的miR-506-3p和自噬相关因子（LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、p62及CollagenⅠ）表达水平;采用RT-qPCR检测miR-506-3p模拟物或miR-506-3p抑制剂转染到HSAS4细胞中对上述自噬相关因子表达水平的影响;利用CCK-8方法检测转染HSAS4细胞增殖效率。

1.5 统计学分析：数据均采用SPSS 22.0软件进行分析，实验至少获得3次数据，数据表示为均值±标准差。组间比较进行配对t检验，两组以上使用单向方差分析，P<0.05显示为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 正常皮肤组织和烧伤组织中miR-506-3p、LC3、Atg5、p62及CollagenⅠ的表达：30例患者正常组织及烧伤组织样本采用RT-qPCR检测miR-506-3p的表达水平。烧伤组织中miR-506-3p的表达水平较正常组织下调，差异有统计学意义（P<0.01），见图1;同时，在烧伤组织中，自噬相关因子LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5及CollagenⅠ也显著上调，而p62的表达则下调，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。

2.2 正常皮肤成纤维细胞和热损伤HSAS4细胞中miR-506-3p以及自噬相关因子的表达：结果表明，不同时段热损伤HSAS4细胞的miR-506-3p的表达低于正常皮肤成纤维细胞，且在48 h时热损伤HSAS4细胞的miR-506-3p表达下调最为明显，差异有统计学意义（P<0.05），见图3。不同时段热损伤HSAS4细胞中自噬相关因子LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5及CollagenⅠ也显著上调，而p62的表达则下调，差异有统计学意义（P<0.05），见图4。

2.3 miR-506-3p对热损傷HSAS4细胞LC3-Ⅱ/Ⅰ比值以及自噬相关因子表达的影响：在热刺激条件下，将miR-506-3p模拟物或miR-506-3p抑制剂转染到HSAS4细胞中，以实现miR-506-3p过表达或低表达。RT-qPCR结果表明，通过miR-506-3p抑制剂转染可显著降低miR-506-3p表达，而通过miR-506-3p模拟物转染可提高miR-506-3p的表达，差异有统计学意义（P<0.05），见图5。进一步的实验中，将miR-506-3p模拟物或miR-506-3p抑制剂转染到HSAS4细胞中，自噬相关因子的检测结果表明，抑制miR-506-3p促进了自噬（LC3-Ⅱ/Ⅰ比值和Atg5上升，p62降低）和CollagenⅠ表达，而miR-506-3p的过表达则显示出相反的作用，差异均有统计学意义（均P<0.05），见图6。

2.4 miR-506-3p对热损伤HSAS4细胞增殖能力的影响：CCK-8分析表明，抑制miR-506-3p可显著增强细胞活力，而miR-506-3p过表达则减少了细胞增殖，见图7。

3  讨论

病理性瘢痕形成是创伤修复的产物，主要表现为成纤维细胞过度增殖和细胞外基质CollagenⅠ、Ⅲ聚集。越来越多的证据表明，miRNA与细胞自噬及增生性瘢痕的关系密切[5]。miRNA对皮肤组织成纤维细胞的形态和细胞行为具有重要作用，Liu等[6]证实miR-181b-5p通过调节MEK/ERK/p21途径促进增生性瘢痕成纤维细胞的增殖并抑制其凋亡。另外，有研究显示miR-506可影响人类不同疾病的细胞生长、分化、癌症转移和侵袭，如宫颈癌[7]、类风湿关节炎[8]及肺纤维化[9]等。本次研究表明，在烧伤的皮肤组织和热损伤的皮肤成纤维细胞中，miR-506-3p表达显著下调。成纤维细胞增殖异常是瘢痕组织过度生长和持续存在的主要原因[10]。进一步研究发现，热刺激皮肤成纤维细胞miR-506-3p过表达显著降低了细胞的增殖能力，提示miR-506-3p在烧伤皮肤的愈合及瘢痕形成中发挥着重要作用。

自噬是细胞的一种程序性死亡方式，对细胞内物质的再利用及稳态维持至关重要。自噬与病理性瘢痕等纤维化疾病密切相关[11]，其通过参与成纤维细胞的凋亡、细胞外基质的合成与降解、细胞因子的分泌等，在瘢痕形成的各阶段发挥着不同作用。越来越多的证据表明，miRNA参与调控自噬的发生，在多个自噬通路中扮演着关键性角色，如慕生枝等[12]发现miR-203过表达可抑制人瘢痕成纤维细胞增殖，其机制可能是通过靶向抑制ΔNp63的表达进而上调P53的蛋白表达;Chen等[13]发现miR-30a通过靶向Beclin-1来调节癌细胞的自噬;卢新星等[14]发现肾小球系膜细胞miR-21过表达可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的活化，降低LC3-Ⅱ表达和增加p62水平，降低自噬水平而减少细胞增殖及细胞外基质堆积。本实验结果显示，与正常皮肤组织相比，烧伤组织和热损伤皮肤的成纤维细胞中miR-506-3p的表达均下调，自噬相关因子（如LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5及CollagenⅠ）显著上调，而p62的表达则下调，表明自噬水平上调，说明热刺激促进了真皮成纤维细胞中的自噬。

为进一步验证miR-506-3p调控自噬水平的能力，笔者将miR-506-3p模拟物或miR-506-3p抑制剂转染到真皮成纤维细胞中，实现miR-506-3p过表达或低表达，通过检测自噬相关因子来反映自噬水平。结果显示，抑制miR-506-3p表达可促进细胞自噬并增加CollagenⅠ表达，而miR-506-3p的过表达则显示出相反作用，提示自噬在烧伤组织发生发展中具有重要作用，也进一步揭示miR-506-3p能够负性调控自噬水平，具体的分子机制尚待进一步研究。

综上所述，烧伤组织和热损伤的成纤维细胞中miR-506-3p表达下调，自噬水平上调，miR-506-3p过表达可抑制皮肤成纤维细胞的自噬和增殖，提示miR-506-3p有可能成为烧伤愈合后瘢痕潜在的治疗靶标。

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[收稿日期]2021-02-04

本文引用格式：史敏，丁欣强，郭晓波，等.MiR-506-3p与自噬相关因子在烧伤后皮肤成纤维细胞中的表达研究[J].中国美容医学，2021，31（5）：86-89.