血清外泌体miRNAs 联合CA72-4 在胃癌诊断中的价值分析*

孙婧悦 王啸

胃癌是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一，在中国的发病率和死亡率均位居前列[1]。由于临床症状不典型，胃癌的早期诊断率较低，多数患者确诊时已处于进展期，预后不佳[2]。目前，CEA、CA199、CA72-4、CA125 是已知的筛选胃癌的重要肿瘤标志物，由于灵敏度不高，在协助诊断胃癌过程中作用有限。因此，寻找诊断胃癌的新型分子标记物，用于早期胃癌的筛查具有重要的临床意义[3]。研究发现，外泌体作为细胞主动分泌的膜囊泡，在肿瘤的发生、发展、侵袭、转移等多方面发挥重要作用[4]。miRNAs 是真核生物中调控mRNA 功能的非编码单链小分子RNA[5]，目前认为外泌体miRNAs 在血液中与蛋白质或脂质体结合存在，以保护其被RNA 酶降解，故可通过抽取外周血检测外泌体miRNAs，为胃癌的筛查及诊断提供新的思路[6]。本研究对胃癌患者及健康人血清外泌体miRNAs进行筛选和验证，初步探讨差异性miRNAs 联合肿瘤标志物在胃癌诊断中的价值，以期实现胃癌的早期诊断，从而改善预后，提高总体生存率。

1 材料与方法

1.1 临床资料

胃癌组：回顾性收集2020 年4 月至2021 年4 月在苏州大学附属第一医院初治的46 例胃癌患者的临床病例资料、肿瘤标志物检测结果及全血标本。纳入标准：1）年龄≥18 岁，ECOG 评分≤2 分；2）经病理学诊断证实为胃腺癌；3）既往没有接受过化疗和（或）放疗的初治胃癌患者；4）心脏、肝脏、肾脏等重要脏器功能正常。排除标准：1）合并除胃癌以外的其他系统恶性肿瘤；2）预计生存时间＜3 个月。

对照组：收集同时期性别和年龄与胃癌组相匹配的健康体检者全血标本20 例。纳入标准：1）无糖尿病、高血压等慢性疾病；2）无恶性肿瘤病史及恶性肿瘤家族史；3）无心脏、肝脏、肾脏等重要脏器功能障碍。排除标准：1）既往有慢性消化系统疾病病史；2）合并幽门螺杆菌感染。

上述所有病例均经研究对象本人及家属知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血清样本收集及外泌体提取 收集对照组和胃癌组患者首次用药前的清晨空腹全血，在抗凝管中室温下进行离心，转速为4 000 rpm，15 min，取出红细胞沉淀，取上清于-80℃冰箱中保存，以用于后续研究。取上述血清1 mL，加入外泌体分离试剂250 μL。混匀后置于4℃，以转速12 000 g 离心20 min，静置2 h。弃上清，所得沉淀用100 μL PBS 重悬，即外泌体。分装后置于-80℃保存。

1.2.2 电镜观察外泌体的形态 吸取10 μL 外泌体于990 μL 的PBS 溶液中，充分混匀，再次吸取稀释后的样品20 μL，滴加到电镜铜网上，10 min 后将铜网侧面的液体吸干，加入10 μL 浓度为20 g/L 磷钨酸于铜网上，室温下负染1 min，继续吸干多余的液体，晾干后将铜网放于槽中使用透射电镜观察。

1.2.3 Western blot 检测外泌体标志蛋白的表达 提取外泌体蛋白质，检测蛋白浓度，随后进行SDSPAGE 凝胶电泳分离蛋白、转膜等步骤，置于含5%脱脂牛奶中封闭，TBST 洗涤3 次。将膜与一抗稀释液孵育（1∶50 000 稀释的抗CD9 抗体、1∶20 000 稀释的CD63 抗体、1∶2 000 稀释的CD81 抗体），4℃过夜，再加入1∶5 000 稀释的二抗室温孵育，暗室显影。

1.2.4 血清外泌体总RNA 的提取及miRNAs 测序

从胃癌组及对照组中，各随机抽取4 例血清样本，严格按照外泌体RNA 提取试剂盒说明书提取血清外泌体RNA，将获得的纯化的miRNAs，送由上海康成生物公司，行文库构建及测序分析，筛选出两组差异表达倍数＞2 且P＜0.01 的外泌体miRNAs。

1.2.5 实时荧光定量PCR 检测miRNAs 表达 取2 μL RNA 样品，按照逆转录试剂盒操作说明书，逆转录成cDNA，取2 μL cDNA 模板，在20 μL 反应体系内行PCR 反应，预变性95℃ 10 min 为1 个循环，变性95℃10 s，退火60℃ 20 s。于LightCycler 480 荧光定量PCR 仪扩增40 个循环后收集数据。引物序列见表1，每个样本重复检测3 次，取平均值作为结果。

表1 miRNAs 引物序列

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析。研究中的数值均以±s表示，计量资料比较采用t检验；双变量的相关性采用Spearman 相关分析，绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析外泌体miRNAs 及CA72-4 在胃癌诊断中的价值。所有统计结果均为双侧检验，检验标准设定α=0.05，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

胃癌组纳入患者46 例，其中男性26 例，女性20 例；年龄42～77 岁，根据第8 版TNM 分期进行分期，其中Ⅰ期10 例，Ⅱ期13 例，Ⅲ期12 例，Ⅳ期11 例；分化程度：高、中、低分化分别为11 例、16 例、19 例；肿瘤位于胃底贲门11 例，胃体20 例，胃窦15 例。对照组纳入标本20 例，其中男性11 例、女性9 例；年龄35～70 岁。

2.1 血清外泌体鉴定结果

两组血清外泌体提取后，通过透射电镜观察形态（图1A）：呈囊泡状，直径约50～150 nm，形态基本相似，为椭圆形，呈双层膜结构。囊泡边缘电子密度较高，颗粒感明显。本研究采用Western blot 检测外泌体标记物表达，进行外泌体鉴定。提示：血清外泌体特异性蛋白CD9、CD63、CD81 表达显著升高（图1B）。

2.2 血清外泌体miRNAs 测序结果

胃癌组及对照组各随机抽取4 例血清样本，进行血清外泌体miRNAs 测序分析，变化倍数＞2 代表差异表达，在胃癌组和对照组血清外泌体中，表达差异显著的miRNAs 共376 个，上调miRNAs 219 个，下调157 个。以差异性表达最显著的25 个miRNAs 作聚类分析（图2A）：红色代表胃癌组血清中表达升高，绿色为表达降低。最终筛选出差异性表达最显著的10个miRNAs（图2B）：miR-1 246、miR-96-5p、miR-202-3p、miR-26a-5p、miR-1 323 表 达 上 调，miR-28-3p、miR-124a、miR-129-2、miR-146a、miR-877-5p 表达下调。

2.3 qRT-PCR 定量验证血清外泌体miRNAs 结果

选取上调的5 个miRNAs 作为研究对象，针对上述miRNAs，设计其上下游引物，并在46 例胃癌患者血清和20 例健康人群血清中行qRT-PCR 检测进行验证，结果为miR-26a-5p、miR-1 323、miR-202-3p、miR-96-5p 在胃癌组血清外泌体中的表达较对照组显著上调（图3），差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。

2.4 验证后的miRNAs 诊断胃癌的效能

胃癌组血清外泌体的miR-26a-5p、miR-1323、miR-202-3p、miR-96-5p 表达显著高于对照组，为进一步评估miRNAs 在胃癌诊断中的价值，采用ROC 曲线进行分析，各ROC 曲线如图4 所示。miR-1323 的灵敏度、特异度及曲线下面积（area under curve，AUC）分别为71.7%、100%、0.908，miR-26a-5p 的灵敏度、特异度及AUC 分别为67.4%、85.0%、0.815，miR-202-3p 的灵敏度、特异度及AUC 分别为30.4%、90.0%、0.570。miR-96-5p 的灵敏度、特异度及AUC分别为19.6%、100%、0.547。

2.5 Spearman 分析诊断胃癌的相关因素

以胃癌发生与否为因变量，将胃癌组和正常组的外泌体miR-1 323、miR-26a-5p、miR-202-3p、miR-96-5p表达水平及CEA、CA199、CA72-4 检测结果行Spearman 相关分析，结果显示：miR-26a-5p、miR-1 323 和CA72-4 与胃癌的发生相关（P＜0.001），而miR-96-5p、miR-202-3p、CEA、CA199 与诊断胃癌无关（表2）。

表2 Spearman 相关分析

2.6 外泌体miR-1 323、miR-26a-5p 联合CA72-4 诊断胃癌的价值分析

血清外泌体miR-1 323、miR-26a-5p 表达水平均可以预测胃癌发生，曲线下面积（area under curve，AUC）均＞0.8。CA72-4 是辅助胃癌筛查及诊断的相关指标之一[7]，本研究提示CA72-4 对胃癌诊断具有一定的预测价值（图5A），AUC 为0.789，灵敏度为60.9%，特异度为95.0%。miR-26a-5p、miR-1 323、CA72-4 三者联合诊断胃癌的AUC 为0.967，明显高于三者单独诊断的AUC（图5B），且联合诊断灵敏度和特异度分别为87.0%、100%，均高于三者单独诊断的灵敏度和特异度。

3 讨论

胃癌作为消化道常见的恶性肿瘤，具有发病率高、早期诊断率低、总体生存率低的特点。目前胃癌诊断的“金标准”为胃镜活检病理，由于费用高及耐受性较差，难以成为大规模筛查胃癌的手段。此外，患者的预后与诊治时期关系密切，早期胃癌相比于进展期胃癌，5 年生存率显著提高。因此，胃癌的早期诊断是改善预后的关键，探究胃癌的早期筛查及诊断标志物具有重要的意义。

外泌体是细胞主动分泌的一种直径约30～100 nm的膜囊泡，最先在哺乳动物网织红细胞中发现，后期相关研究进一步发现，在淋巴细胞和肿瘤细胞中，均有外泌体的分泌，且在腹水、血液、脑脊液及细胞培养液中可以稳定存在[8]，外泌体通过释放miRNAs 和蛋白质，完成细胞间的信息交流[9]。

本研究共收集了20 例健康人和46 例初治胃癌患者的血清标本，在胃癌组和对照组中各随机抽取4例血清样本，提取外泌体后，进行外泌体miRNAs 测序分析，共筛选出376 个表达差异的miRNAs，其中胃癌组中表达上调的miRNAs 219 个，表达下调的miRNAs 157 个。由于上调的miRNAs 数量显著高于下调的miRNAs，且差异表达的倍数越高，则诊断价值越大[10]。因此，本研究选取在胃癌组血清外泌体中表达上调最显著的5 个miRNAs，并通过qRT-PCR 进行验证，排除了miR-1 246。

肿瘤标志物CEA、CA199、CA72-4 是筛查胃癌的重要指标，本研究中将上述3 个肿瘤指标纳入胃癌诊断的Spearman 相关分析中，结果提示CEA 和CA199 均与胃癌诊断无相关性。CEA 作为广谱肿瘤标记物，其特异性较低，在胃癌等多种实体肿瘤中均会显著升高，CA199 作为胰腺癌的经典标志物，在胃癌的诊断中也有一定的参考价值。本研究的结果与既往临床观察不一致，可能与收集的胃癌病例数有限、胃癌患者及正常患者的例数不匹配、实验过程中存在误差等因素相关，后续需要进一步扩大临床样本量，并对大样本进行反复多次的检测。通过Spearman 相关分析，CA72-4、miR-26a-5p 和miR-1 323 与胃癌诊断相关，而本研究对三者均绘制了胃癌诊断预测的ROC曲线图，结果示三者单独的AUC 均高于0.5。该结果提示：在大样本人群胃癌的筛查中，需高度警惕上述各指标的异常情况，并积极采取相应的措施，以降低胃癌的漏诊率。

针对上述3 个变量，根据既往研究查看：1）miR-26a-5p 可以通过靶向COL10A1 增强胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭[11]；2）在食管癌研究中，circLARP4 可抑制细胞增殖，该抑制作用可被miR-1 323 所逆转[12]；3）血清胃蛋白酶原、CA72-4 联合胃泌素17 检测对早期胃癌的筛查和诊断具有较高的敏感性和特异性，具有较高的临床应用价值[13]。除上述3 项研究，另有学者探讨了miR-26a-5p、miR-1 323、CA72-4 与胃癌诊断的相关性[14-16]。结合本研究结果及上述研究，推测三者对胃癌诊断的预测均有一定的价值。此外，三者联合预测胃癌诊断的AUC 明显大于三者单独预测。提示外泌体miR-26a-5p 及miR1323 联合CA72-4 对胃癌诊断具有更高的临床价值。

本研究存在一定的局限性，外泌体的鉴定采用标记物检测及电镜观察，缺乏粒径分析结果。此外，受到样本量的限制，未分别对早、中、晚期胃癌患者外泌体miRNAs 和胃癌发生进行分析，在后续研究中，将继续扩大样本量，尤其是加强早期病例的收集，并对早、中、晚期患者进行分层分析，以期最大程度发掘miRNAs对早期胃癌的诊断价值。

综上所述，本研究通过对胃癌患者和健康人的血清外泌体miRNAs 测序验证，以及肿瘤标志物的统计分析，筛选出miR-26a-5p、miR-1 323 和CA72-4 均在胃癌诊断中有一定的价值。进一步分析发现，上述三者联合诊断胃癌具有更高的价值。由于外泌体miRNAs与蛋白质或脂质体结合，不被RNA 酶降解，具有较高的稳定性，因此，相比于胃镜检查，联合检测外周血外泌体miRNAs 及CA72-4 更容易被接受用于胃癌的筛查及诊断，具有较好的应用前景，有望提高胃癌的早期诊断率。