MTHFR 基因多态性和脂蛋白磷脂酶A2 在糖尿病周围血管病变中的分析

刘倩文，周国强，叶柱均，张志坚，吴春华

（1.东莞市康华医院病理科，广东 东莞523000；东莞市万江医院，2.检验科，3.内科，广东 东莞523050）

2 型糖尿病患者是全身性的代谢紊乱型疾病，高血糖会通过多种途径影响血管结构与功能，其中周围血管病变（Peripheral vascular disease，PVD）是较为常见且严重的并发症之一， 对于糖尿病患者指的是下肢血管病变， 可能导致糖尿病足部溃疡和下肢截肢， 早期诊断和干预对于2 型糖尿病患者预后有着重要意义[1]。 亚甲基四氢叶酸还原酶（5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因是编码人体叶酸代谢中关键酶的基因， 既往研究表明其基因多态性与动脉粥样硬化等心脑血管疾病密切相关[2]；脂蛋白相关磷脂酶A2（Lipoprotein phospholipase A2，Lp-PLA2） 是新近发现的一种血管特异性炎症酶， 国内外相关研究表明其亦参与了动脉粥样硬化过程， 是心脑血管疾病风险的预测因子[3-4]。通过对比实验以探讨MTHFR 基因多态性与血清Lp-PLA2 水平与糖尿病PVD 发生的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取东莞市康华医院及万江医院2016 年12 月至2019 年8 月收治的2 型糖尿病患者60 例，纳入标准：均符合《中国2 型糖尿病防治指南2013 版》[5]， 典型的糖尿病症状 （如多食、多饮、多尿或体重下降），血浆葡萄糖水平/口服葡萄糖耐量试验 （OGTT）2 h 血糖水平≥11.1 mmol/L，或是空腹血浆葡萄糖水平≥7.0 mmol/L 中，无糖尿病症状者需要改日重复测定血糖确诊。 排除标准：合并心肝肾器质性疾病者； 合并各种急慢性炎症或免疫性疾病者；合并恶性肿瘤者；近1 月内有服用抗炎类药物者。 本研究已经医院伦理委员会批准，患者均对此知情并同意。

60 例糖尿病患者中属于单纯糖尿病（DM 组）27 例， 糖尿病合并周围血管病 （DM+PVD 组）33例，选择同期体检健康志愿者30 例作为健康组对照。 三组间性别、年龄、BMI 等一般情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 三组间一般情况的比较

1.2 研究方法 PVD 诊断：采用多普勒超声（美国惠普HP5500） 对60 例糖尿病患者进行下肢血管检查，患者取仰卧位或者俯卧位，从腹股沟位置顺着血管走向由上至下检查下肢血管， 观察血管内径、厚度、走行、有无血栓情况等，若存在血管狭窄或闭塞即可诊断为PVD。

血清生化指标的测定： 对所有2 型糖尿病患者采用清晨抽取空腹血，分离血清，采用全自动生化分析仪（日本日立公司生产，型号7180）检测血清生化指标水平，包括空腹血糖（Fasting blood glucose，FPG)、总 胆 固 醇（Total cholesterol，TC）、甘 油三酯（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（High density lipoprotein，HDL）与低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）。 糖 化 血 红 蛋 白(Glycosylated hemoglobin，HbA1c)测定：采用硼酸亲和色谱层析法， 采集患者肘静脉血2 mL， 装入EDTA 抗凝管（美国BD 公司，型号367841）中，轻轻颠倒混匀，通过精确称量、定容及超声处理后，利用取样器吸取一定量的全血标本，利用特定蛋白分析仪（广东优尼德生物科技有限公司生产，货号UNT5000）测量其在415 nm 的吸收度，通过数据处理软件得出HbA1c 值，以百分率表示。 Lp-PLA2 测定：采用半自动比浊法，采集患者肘静脉血2 mL，装入EDTA抗凝管中，离心10 分钟，转速为1500 转/min，取上清液，利用Lp-PLA2 定量检测试剂盒（南京诺尔曼生物有限公司）进行测定。

MTHFR 基因多态性采用PCR-荧光法检测，检测试剂为江西诺德医疗器械有限公司MTHFR（C677T）基因检测试剂盒，按照说明书进行操作。

1.3 观察指标 比较三组的血清生化指标和MTHFR（C677T）基因型分布，评估它们与PVD 发生之间的相关性。

1.4 统计学方法 采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据的统计分析处理，三组间计量资料（±s）的比较采用单因素分析，两两间比较采用独立样本t 检验，计数资料（%）的比较采用卡方检验χ2，采用Logistic 回归分析评估糖尿病周围血管病变的独立影响因素。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清生化指标的比较 三组间血清TC、TG、HDL 和LDL 比较， 差异均无统计学意义 （P＞0.05）；DM+PVD 组 与DM 组 血 清HbA1c、FPG 与Lp-PLA2 均明显高于健康组 （P＜0.05）， 且DM+PVD 组血清Lp-PLA2 水平高于DM 组 （P＜0.05），见表2。

表2 三组血清生化指标的比较（±s）

表2 三组血清生化指标的比较（±s）

注：a 与健康组相比P＜0.05，差异有统计学意义；b 与DM 组相比P＜0.05，差异有统计学意义。

组别 n HbA1c/% HDL/（mmol/L） LDL/（mmol/L） Lp-PLA2/（μg/L）DM+PVD 组DM组健康组33 27 30 F P 8.03±1.75a 7.96±1.67a 5.86±0.76 21.263＜0.001 FPG/（mmol/L）7.35±2.86a 7.46±2.77a 4.83±0.59 12.203＜0.001 TC/（mmol/L） TG/（mmol/L）4.58±1.20 4.42±1.13 3.97±1.08 2.373 0.099 1.73±0.71 1.65±0.68 1.62±0.70 0.210 0.811 1.04±0.42 1.07±0.49 1.11±0.35 0.218 0.805 2.58±0.87 2.51±0.81 2.42±0.76 0.302 0.740 205.89±51.68ab 176.61±46.03a 113.16±42.65 31.349＜0.001

2.2 三组MTHFR（C677T）基因多态性分布的比较DM+PVD 组患者MTHFR 的CC 基因型比例低于健康组（P＜0.05），而MTHFR 的TT 基因型比例和T 等位基因频率均高于健康组和DM 组（P＜0.05），DM 组与健康组间MTHFR 基因多态性分布比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 三组MTHFR（C677T）基因多态性分布（例，%）

2.3 DM 患者PVD 发生与Lp-PLA2 和MTHFR 基因多态性的关系分析 经Logistic 回归分析结果显示，DM 患者PVD 的发生与Lp-PLA2 和MTHFR的TT 基因型与T 等位基因频率呈显著正相关，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 DM 患者PVD 发生与Lp-PLA2 和MTHFR 基因多态性关系的Logistic 回归分析

3 讨论

PVD 是一种慢性肢体缺血性疾病， 主要症状为动脉粥样硬化， 临床表现为动脉壁弹力层和基层被破坏等， 从而使患者管壁脆性增加， 弹性降低。 糖尿病患者发生PVD，可能导致糖尿病足、坏疽截肢，严重危害患者生命健康，早期诊断和监测PVD 对于改善糖尿病患者预后意义重大[6]。 既往研究指出，MTHFR 变异体可能对糖尿病及其并发症的病理生理起重要作用， 是动脉疾病发展以及静脉血栓形成的危险因素[7]，而Lp-PLA2 会随着肥胖而增加，可能会对血管功能产生不利影响[8-9]，本文主要探讨这两种因素与DM 患者PVD 发生的关系。

本研究通过对比了健康人群、DM 与DM+PVD患者的血清生化指标和MTHFR 基因多态性，结果显示，DM 患者与DM+PVD 患者的血清FPG、HbA1c 与脂代谢水平没有明显差异， 而血清Lp-PLA2 浓度在健康人群、DM 患者和DM+PVD 患者中依次升高， 且其血清浓度与PVD 的发生呈现显著的正相关关系。 Lp-PLA2 是一种由血管内膜中的巨噬细胞、T 细胞和肥大细胞分泌的磷脂酶，能够促使氧化磷脂水解， 产生游离脂肪酸和溶血磷脂等脂质类促炎物质， 这些物质可以通过趋化炎症细胞进一步产生级联放大， 产生更多的促炎物质，同时介导内皮细胞死亡和内皮功能异常，促进动脉粥样硬化[10]。 Ikonomidis I 等学者发现，Lp-PLA2 浓度升高与冠心病患者的内皮功能障碍、颈动脉粥样硬化、冠状动脉血流储备受损、动脉僵硬度增加等不良并发症有关， 而他们认为Lp-PLA2会损害内皮功能和动脉壁， 所有可以作为慢性冠脉综合征中的预后因子[11-12]。 因此，Lp-PLA2 在PVD 的发生中起着促进作用， 其血清浓度有可能作为PVD 风险的预测因子。

MTHFR 基因编码的MTHFR 蛋白能催化叶酸和甲硫氨酸代谢，作为甲基供体参与了体内嘌呤、嘧啶的合成，以及DNA、RNA、蛋白质的甲基化，同时维持着体内半胱氨酸水平[13]。 本文结果发现DM+PVD 组TT 基因型比例和T 等位基因频率均处于高水平， 并且经Logistic 回归分析结果显示，PVD 的发生与TT 基因型比例和T 等位基因频率存在较明显的正相关关系。 MTHFR 第677 位点的C 碱基被T 碱基置换，其编码的丙氨酸被缬氨酸取代后，由于C677T 位于MTHFR 催化区域，这种碱基突变直接影响了MTHFR 蛋白酶活性和耐热性下降，引起半胱氨酸水平升高，产生细胞毒性，损伤血管内皮细胞，刺激平滑肌细胞增生，机体凝血和纤溶系统被破坏，最终导致了粥样硬化[14-15]。Settin A 等多位学者研究[16-17]发现MTHFR 677T 等位基因是糖尿病视网膜病变、 糖尿病多发性神经病和缺血性心脏病的危险因素， 与本研究结果呈现一致性。

综上，MTHFR 基因C677T 多态性与糖尿病患者PVD 的发生相关，TT 基因型和T 等位基因频率均为PVD 发生的高危因素，且血清Lp-PLA2 水平的升高可能参与了PVD 的发生与发展。