HPLC法测定肝素钠注射液中6种抑菌剂

由鹏飞，李春焕，陈晓，张迅杰，薛维丽，张乃斌

(山东省食品药品检验研究院，国家药品监督管理局仿制药研究与评价重点实验室，山东省仿制药一致性评价工程技术研究中心，山东 济南 250101)

肝素钠注射液为肝素钠的灭菌水溶液，主要用于心脑血管疾病和血液透析治疗。《中国药典》2020年版中规定多剂量包装的注射液可加适宜的抑菌剂，静脉给药与脑池内、硬膜外、椎管内用的注射液均不得加抑菌剂[1]，肝素钠注射液属于单剂量包装的注射剂，且各生产企业说明书中用法用量均包括静脉注射及静脉滴注，目前仍有部分企业添加苯酚作为抑菌剂。注射液中常用的抑菌剂有：醇类(苯甲醇、三氯叔丁醇)、酚类(苯酚)、酯类(羟苯酯类)等[2-5]，不同抑菌剂的机理不同，但普遍存在一定的毒副作用[6-8]，如苯酚有致癌风险，苯甲醇的降解和代谢产物苯甲醛具有中枢神经系统毒性，三氯叔丁醇可导致溶血反应，羟苯酯类可导致过敏反应等，因此，有必要对肝素钠注射液进行抑菌剂检查。目前已有高效液相色谱(HPLC)法测定肝素钠注射液中苯酚的报道[9]，但其中未对其他抑菌剂进行检测，因此本文建立了HPLC法同时测定肝素钠注射液中苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇、羟苯甲酯、羟苯乙酯及羟苯丙酯等6种抑菌剂的含量，为更好地质控肝素钠注射液的质量提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-20A液相色谱仪(日本岛津公司)，PDA检测器；Mettler Toledo XSE205DU电子天平(德国梅特勒公司)。

1.2 试剂试药 甲醇为色谱纯；水为Millipore Q-POD制备的纯化水；其他试剂均为分析纯。

肝素钠注射液：来自2021年国家评价性抽验，包括11家生产企业共100批样品。

对照品：苯酚(中检院，批号：100509-201804，含量：100.0%)；苯甲醇(中检院，批号：190019-202004，含量：99.7%)；三氯叔丁醇(Cato Research Chemicals，批号：0622-RB-0005，含量：99.8%)；羟苯甲酯(中检院，批号：100278-201906，含量：99.9%)；羟苯乙酯(中检院，批号：100847-202105，含量：100.0%)；羟苯丙酯(中检院，批号：100444-202005，含量：99.9%)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相A为水，流动相B为甲醇，洗脱程序见表1，流速：1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，进样量20 μL。检测波长：苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇选择220 nm；羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯选择256 nm。

表1 HPLC 梯度洗脱程序

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液 分别精密称取苯酚、苯甲醇、羟苯甲酯、羟苯乙酯、三氯叔丁醇及羟苯丙酯标准品约25 mg置10 mg量瓶中，用甲醇-水(1∶1)溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成6种对照品贮备溶液，分别精密量取上述贮备溶液适量，用甲醇-水(1∶1)溶液稀释成浓度分别为400.06、1671.88、490.4、85.81、793.54、80.45 μg·mL-1的对照品溶液1。

2.2.2 供试品溶液 分别精密量取肝素钠注射液1 mL置25 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

2.3 系统适用性 精密量取20 μL“2.2.1”项下对照品溶液1进样，记录色谱图，出峰顺序依次为苯酚、苯甲醇、羟苯甲酯、羟苯乙酯、三氯叔丁醇及羟苯丙酯(见图1)。各相邻峰之间的分离度均不小于1.5。

图1 系统适用性试验色谱图

2.4 线性关系试验 精密量取“2.2.1”项下对照品溶液1，逐级稀释成含苯酚浓度为200.03、100.02、50.01、25.00 μg·mL-1；含苯甲醇浓度为835.94、417.97、208.99、104.49 μg·mL-1；含羟苯甲酯浓度为245.20、122.60、61.30、30.65 μg·mL-1；含羟苯乙酯浓度为42.91、21.45、10.73、5.36 μg·mL-1；含三氯叔丁醇浓度为396.77、198.39、99.19、49.60 μg·mL-1；含羟苯丙酯浓度为40.23、20.11、10.06、5.03 μg·mL-1的对照品溶液2～5，分别精密吸取系列对照品溶液20 μL，注入液相色谱仪，测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，结果见表2。

表2 线性关系考察结果

2.5 系统精密度试验 精密量取20 μL对照品溶液3，连续进样6 次，记录色谱图，测其峰面积，计算RSD。苯酚、苯甲醇、羟苯甲酯、羟苯乙酯、三氯叔丁醇及羟苯丙酯峰面积的RSD分别为0.10%、0.20%、0.03%、0.06%、0.49%、0.13%，表明系统精密度良好。

2.6 稳定性试验 取“2.4”项下制备的对照品溶液3，精密吸取20 μL，注入液相色谱仪，每隔5 h进样一次，测定6种抑菌剂的峰面积，共考察25 h，计算峰面积的RSD，以观察在检测过程中待测成分的稳定性。苯酚、苯甲醇、羟苯甲酯、羟苯乙酯、三氯叔丁醇及羟苯丙酯峰面积的RSD分别为0.12%、0.73%、0.02%、0.24%、0.58%、0.12%，试验结果表明，对照品溶液在25 h内稳定性良好，能够满足测定需要。

2.7 定量限测定 取对照品溶液进行稀释后进样，以信噪比S/N=10 计，苯酚的定量限为0.1 μg·mL-1、苯甲醇的定量限为1 μg·mL-1、三氯叔丁醇的定量限为20 μg·mL-1、羟苯甲酯的定量限为0.03 μg·mL-1、羟苯乙酯的定量限为0.1 μg·mL-1、羟苯丙酯的定量限为0.3 μg·mL-1。

2.8 加样回收率试验 精密量取肝素钠注射剂(处方中苯酚的含量为2.5 mg·mL-1)4 mL置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度。再分别精密量取2、2.5、3 mL对照品溶液1置20 mL量瓶中，分别精密加入供试品溶液10 mL，用水稀释至刻度，摇匀，制成低、中、高浓度的溶液，分别进样10 μL，记录色谱图，计算苯酚、苯甲醇、羟苯甲酯、羟苯乙酯、三氯叔丁醇和羟苯丙酯的回收率，结果见表3。结果表明，6种抑菌剂回收率在90%～110%，RSD均不超过2.0%。

表3 加样回收率试验结果

2.9 样品测定 取收集到的11家企业100个生产批次的肝素钠注射液样品，以“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算抑菌剂含量。检出3家生产企业使用苯酚作为抑菌剂，其他抑菌剂未检出。本次检验的结果表明，11家生产企业中有3家工艺处方中添加苯酚，测定结果与理论加入量相符，未检出其他5种抑菌剂；其他8家企业工艺处方中未添加抑菌剂，6种抑菌剂均未检出。

3 讨论

虽然抑菌剂在规定的使用浓度范围内一般是安全的，但由于其本身存在毒性，仍会导致一些不良反应发生，因此应加强对注射剂中抑菌剂的监管和检测，特别对于单剂量包装的注射剂，应尽量避免抑菌剂的使用。我们根据各肝素钠注射液生产企业中苯酚的理论加入量以及文献报道[10-11]，确定了6种抑菌剂的对照品溶液的浓度，方法学验证结果表明，本文建立的HPLC法适用于肝素钠注射液中苯酚、苯甲醇、羟苯甲酯、羟苯乙酯、三氯叔丁醇和羟苯丙酯等6种抑菌剂的含量测定，可作为肝素钠注射液质量安全评价方法，为更好地控制肝素钠注射液的质量提供依据。