基于网络药理学及分子对接技术分析丹参-川芎-葛根抗高血压的分子机制

李新，刘肖莹，蒋蕾，杨波*，彭海生*

(1.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150076；2.哈尔滨医科大学大庆校区药学院，黑龙江 大庆 163319)

高血压是引起冠心病和脑卒中等心脑血管疾病的危险因素[1]。人口老龄化的加剧以及青年群体不健康的生活饮食习惯，增加了高血压的发病概率[2]，因此防治高血压已成为我国公共卫生安全的一项严峻挑战[3]。前临床使用的化药降压药有ACEI类、β受体阻滞剂、利尿剂、钙离子拮抗剂四大类。而在我国中医古籍对高血压无直接论述，而是以“眩晕”“头痛”等进行治疗[4]，丹参-川芎-葛根是常与西药降压药联用的药物，由丹参、川芎、葛根三味药组成。赵健[5]研究表明，丹参-川芎-葛根和苯磺酸氨氯地平联用，可安全有效的治疗高血压；而丹参、川芎、葛根也常用于治疗高血压的方剂中，但是丹参-川芎-葛根降血压的机制尚不明确。

网络药理学最初由Hopkins[6]于2007年率先提出，从系统生物学角度研究并阐释中药作用成分及作用机制，这与传统中药通过多成分、多靶点对机体进行整体作用的观点相一致[7]。本研究利用网络药理学的方法分析丹参-川芎-葛根治疗高血压的分子机制，为进一步研究提供思路。

1 材料与方法

1.1 筛选丹参、川芎、葛根活性成分及作用靶点 以丹参、川芎、葛根为词条，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug-like，DL)≥0.18作为条件[8]，在中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP)(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.Php)筛选活性成分和作用靶点。在UniProt数据库(https://www.uniprot.org)，进行靶点标准化。以“Hypertension”为词条，检索Genecards(https://www.genecards.org)数据库，得到高血压相关靶点。

1.2 “药材-活性成分-靶点蛋白”网络的构建 利用Cytoscape 3.6.0版软件，将筛选出的活性成分和靶点构建“药材-活性成分-靶点蛋白”网络图。

1.3 有效成分与疾病靶点的韦恩图及靶点蛋白相互作用(PPI)网络的构建 运用韦恩图数据库(Venn Diagram，Venny)(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)合并活性成分靶点和高血压相关靶点，获得交集靶点。STRING在线分析平台(https://string-db.org/)，选择置信度>0.7的交集靶点[9]，预测靶点与靶点之间的相互作用关系，构建抗高血压靶点PPI网络图。

1.4 通路富集分析 用RStudio-1.4.1106进行基因的本体(gene ontology，GO)生物学过程富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，并对分析结果进行可视化分析，建立靶点蛋白和通路的联系，并构建“活性成分-靶点-通路”网络。

1.5 分子对接 将PPI网络图中得到的核心靶点与活性成分进行分子对接。在TCMSP数据库中下载活性成分的mol2格式。从PDB数据库(https：//www.rcsb.org/)获得靶蛋白的pdb格式[10]。通过AutoDock Tools 1.5.6版软件处理靶蛋白，去除水分子，添加全氢，分离配体和受体，保存为pdbqt格式。将活性成分导入AutoDock Tools 1.5.6软件，添加全氢，分配原子类型，所有柔性键均默认可旋转，保存为pdbqt格式。将处理后的靶蛋白和活性成分进行对接，并运用Pymol进行可视化处理。

2 结果

2.1 丹参-川芎-葛根活性成分及作用靶点筛选结果 通过TCMSP数据库的筛选共获得68个已知有效活性成分，其中丹参59个，川芎6个，葛根3个。通过Genecards数据库以相关性>10为筛选条件[11]，得到759个与高血压相关的靶点。活性成分见表1。

表1 丹参-川芎-葛根筛选后得到的68个活性成分

表1(续)

2.2 “药材-活性成分-靶点”网络图构建结果 通过Cytoscape 3.6.0软件构建药材-活性成分-靶点网络图(见图1)。其中共包含217个节点(68个活性成分和146个靶点)，1 045条线。红色菱形代表靶点；蓝色六边形代表党参活性成分；绿色六边形代表川芎活性成分；黄色六边形代表葛根活性成分。度值(degree)和节点(betweenness)与活性成分呈正相关状态，节点越大，越重要[12]。

图1 药材-成分-靶点图

2.3 有效成分靶点与疾病靶点韦恩图及PPI网络的建立与分析 在Venny数据库共获得62个疾病和药材的交集靶点(见图2)。将得到的交集靶点，导入STRING在线分析平台得到抗高血压靶点PPI网络关系，并导入Cytoscape 3.6.0进行进一步的拓扑分析(见图3)。最终获得人内皮型一氧化氮合酶(NOS3)、蛋白激酶Bα2(AKT1)、白细胞介素-6(IL-6)、低聚果糖(FOS)、血管内皮生长因子(AVEGFA)和内皮素1(EDN1)等关键靶点。

图2 韦恩图

图3 抗高血压靶点PPI网络图

2.4 通路富集分析 运用RStudio 1.2.5019软件得到1 871个GO富集条目(P<0.05)，其中生物过程(biological process，BP)条目1 767个，细胞组成(cellular component，CC)条目21个，分子功能(molecular function，MF)相关的条目74个。取前10的BP、CC、MF过程建立富集通路(见图4)。KEGG通路富集，筛选出129条信号通路(P<0.05)，取基因占比前20的疾病相关通路利用RStudio 1.2.5019软件制作可视化气泡图，结果见图5。

筛选出11条与高血压可能相关的通路，构建“成分-靶点-通路”多维网络(见图6)。其节点大小和颜色深度与它们在网络中的度值有关。圆形代表通路；菱形代表成分；箭头代表靶点。由图可知，流体剪切应力和动脉粥样硬化、钙信号通路、AGE-RAGE、松弛素、cGMP-PKG等11个信号通路，共涉及58个活性成分，46个靶点。

其中准确度最高(P最小)的是流体剪切应力和动脉粥样硬化通路(fluid shear stress and atherosclerosis)，其富集通路见图7。由图可知丹参-川芎-葛根主要通过作用于VEGFR、NOS3、AKT1等靶蛋白调控流体剪切应力和动脉粥样硬化通路，起到抗高血压及其并发症的作用。

图6 丹参-川芎-葛根活性成分-靶点-通路图

图7 流体剪切应力和动脉粥样硬化通路

2.5 分子对接 将“药材-活性成分-靶点”网络中“degree”>20的活性成分，与关键靶点NOS3、AKT1、IL-6、FOS、VEGFA和EDN1进行结合能预测，结果见表2。用PyMOL软件将对接结果可视化，结果见图8。Hsin等[13]证明结合能<-4.25 kcal·mol-1提示配体与受体有一定的结合活性，<-5.0 kcal·mol-1有较好的结合活性，<-7.0 kcal·mol-1有强烈的结合活性。

a.隐丹参酮-NOS3；b.β-谷甾醇-FOS；c.丹参酮ⅡA-EDN1；d.丹参酮ⅡA-EDN1；e.丹参酮ⅡA-VEGFA；f.β-谷甾醇-AKT1图8 分子对接模式图

表2 活性成分及靶蛋白结合能预测

3 讨论

借助网络药理学的方法，整理得到了抗高血压作用的68个化学成分，62个潜在靶点。丹参-川芎-葛根相互作用网络，体现出一个成分与多个靶点相关联，一个靶点与多种成分相关联的机制。通过对丹参的分析，其主要降压成分是酮类化合物，丹参酮ⅡA通过降低NO水平，抑制内皮素-1(ET-1)生成，起到降血压的目的[14]。川芎中降血压的主要活性成分为杨梅酮，杨梅酮可以显著提高磷酸化AKT的水平，降低p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)的磷酸化和核因子κB/p65的水平[15]。葛根中降血压的主要活性成分有β-谷甾醇和芒柄花黄素，β-谷甾醇可降低血脂[16]；芒柄花黄素主要是通过下调p47phox和NOX4的mRNA含量间接性对降血压起到作用[17]。

从PPI网络图得到核心靶点NOS3、FOS、EDN1、VEGFA、IL-6、AKT1。辛颖等[18]研究发现，NOS3基因多态性与高血压继发左心室肥厚相关联；Wu等[19]证明FOS基因与肾髓质性高血压有关；Jiao等[20]研究表明，EDN1基因与肺动脉高压有关；谢志伟[21]的研究表明，VEGFA基因与高血压密切相关；吴阿敏[22]研究表明IL-6蛋白与低氧肺动脉高压有关；齐书涵等[23]研究表明，血管重构与高血压循环作用，而AKT1对血管重构有重要作用。

GO富集分析结果显示，丹参-川芎-葛根的核心靶点是通过影响血管内皮功能、药物反应及氧化应激等生物过程对高血压病进行调控。KEGG通路富集分析结果显示，丹参-川芎-葛根通过调节流体剪切应力和动脉粥样硬化、钙信号通路、AGE-RAGE、松弛素、cGMP-PKG信号通路来治疗高血压。较高的血流剪切力对维持血管内皮功能有利，减少内皮损伤因子分泌，保护血管内膜，起到预防高血压的作用[24]。钙信号传导机制对心脏和血管等相关疾病发挥重要作用[25]。海长娥等[26]研究证明高血压与AGE-RAGEA密切相关。高血压患者的血浆松弛素水平明显下降[27]。cGMP促使NO松弛血管平滑肌[28-29]。施伟丽等[30]证实激活cGMP-PKG信号通路对自发性高血压有疗效。

综上所述，利用网络药理学和分子对接技术，对丹参-川芎-葛根治疗高血压的作用机制做了初步探讨。结果显示，木犀草素和丹参酮ⅡA等成分主要通过流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路，作用于NOS3、AKT1、IL-6、FOS、VEGFA和EDN1等靶点发挥作用。为进一步研究高血压药物提供参考。