非洲马瘟病毒实时荧光RT-RPA快速检测方法的建立

史卫军，林彦星，黄超华，曹琛福，曾少灵，吴 江，刘建利，陈 兵，阮周曦，花群义

（深圳海关动植物检验检疫技术中心，广东深圳 518045）

非洲马瘟（African horse sickness，AHS）是由非洲马瘟病毒（African horse sickness virus，AHSV）感染马属动物引起的一种急性或亚急性非接触性虫媒传染病[1]，拟蚊库蠓（Culicoides imicola）是其主要传播媒介[2]，动物发病后以发热、水肿、脏器出血为主要特征。所有马属动物均可感染AHSV，马最易感，骡和驴次之，易感动物感染后病死率可达95%[3]。该病主要分布在非洲撒哈拉沙漠以南地区，地中海周边国家、中东、欧洲等地偶有发生，近年来在亚洲个别国家也有流行，我国尚未有AHS 流行的报道[4]。世界动物卫生组织（WOAH）将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病和要重点防范的外来动物疫病。

AHSV 属于呼肠病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus genus）成员，已知有9 种血清型，不同血清型病毒毒力不同，各型之间具有交互免疫关系，如1 型和2 型，3 型和7 型，5 型与8 型，6型与9 型[5-6]。AHSV 基因组由10 个大小不等的双链RNA 片段构成，编码7 种结构蛋白（VP1—VP7）和4 种非结构蛋白（NS1—NS3、NS3A）。其中，VP7 蛋白在AHSV 各血清型中高度保守，是病毒血清群的特异性抗原[7]，因此编码VP7 蛋白的S7基因常被用于AHSV 检测[8]。

目前国内外学者已建立了多种AHSV 检测方法，如常规RT-PCR、实时荧光RT-PCR、RT-LAMP 等，但这些方法均耗时较长，且操作复杂。重组酶聚合酶扩增技术（RPA）是一种在恒温（37～42 ℃）条件下即可实现核酸扩增的新技术，反应程序简单，没有PCR 的高温变性、退火和延伸等步骤，而且反应时间不到PCR 的20%。实时荧光RPA 方法是将荧光探针技术与RPA 技术相结合，在20 min 内直接通过便携式等温扩增仪读取检测结果的新方法，在动物疫病现场快速诊断方面具有广阔的应用前景[9]。本研究选取AHSVS7基因保守序列为靶基因，通过设计特异性引物和探针，建立了AHSV 实时荧光RT-RPA 检测方法，以期为AHS 防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 重组质粒和样本

根据GenBank中发布的AHSVS7基因序列（登录号：KT187143.2），合成该基因片段并克隆到pMD18-T 载体中，构建重组质粒，命名为AHSVVP7。蓝舌病病毒（BTV）灭活抗原、鹿流行性出血症病毒（EHDV）灭活抗原，由作者所在实验室保存；马流感病毒（EIV）灭活抗原、马传染性贫血病病毒（EIAV）灭活抗原、马动脉炎病毒（EAV）灭活抗原，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供；40 份马血和20 份驴血临床样品，采自云南、内蒙古、广西等地。

1.2 主要试剂和仪器

RNA 提取试剂盒MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit，购自美国Thermo 公司；实时荧光RT-RPA 扩增试剂盒Twist Amp exo RT kit，购自英国TwistDx 公司；一步法荧光定量RT-PCR 试剂盒AgPath-IDTMOne Step RT-PCR Kit，购自美国ABI 公司。全自动磁珠提取纯化系统，购自美国Thermo 公司；T16-ISO 等温扩增仪，购自澳大利亚Axxin 公司；7500 实时荧光PCR 仪，购自美国ABI 公司。

1.3 引物和探针设计

分析GenBank 中公布的AHSV 9 种血清型S7基因保守序列，根据RPA 引物和探针设计原则，设计多条特异性引物和探针，通过交叉试验筛选最佳组合。

1.4 核酸提取

按照RNA 抽提试剂盒说明书，分别提取灭活抗原和临床样品核酸，于-80 ℃冻存备用。

1.5 反应体系和反应条件

按照Twist Amp exo RT Kit 试剂盒说明书进行RPA 扩增。分别吸取水化缓冲液29.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.1 μL，探针（10 μmol/L）0.6 μL，DEPC 水11.2 μL，模板2.0 μL，混合均匀后转移至含有冻干酶粉反应管中，震荡混匀后加入醋酸镁溶液（280 mmol/L）2.5 μL，混匀后将反应管置入等温扩增仪中，在恒温条件下反应4 min 后取出再次混匀，继续反应16 min，实时监测FAM荧光信号。反应温度分别设置为37、38、39、40、41、42 ℃，筛选最佳温度。

1.6 特异性试验

在最佳反应温度下，分别对AHSV-VP7、BTV、EHDV、EIV、EIAV、EAV等进行RT-RPA检测，并设置阴性和空白对照。

1.7 灵敏度试验

测定重组质粒AHSV-VP7 浓度，根据公式：拷贝数（copies/μL）=6×1023×重组质粒浓度×10-9/ 碱基数×660，得到AHSV-VP7 拷贝数为2.36×109copies/μL[10]。用DEPC 水 对AHSV-VP7 进行10 倍梯度稀释，得到浓度范围为2.36×104～2.36×100copies/μL 的系列稀释样品。同时使用RT-RPA 法和实时荧光RT-PCR 法[11]对上述系列稀释样品进行检测，测定本方法的灵敏度。

1.8 重复性试验

选取浓度为2.36×104、2.36×101、2.36×100copies/μL 的重组质粒AHSV-VP7 作为模板分别进行RT-RPA 试验，重复检测3 次，分析该方法的稳定性。

1.9 临床样品检测

利用本研究建立的RT-RPA 法和实时荧光RTPCR 法，同时对40 份马血样品和20 份驴血样品进行平行检测，计算两种方法的符合率。

2 结果

2.1 最佳反应条件确定

通过交叉试验筛选最佳引物和探针组合，即选择其中1 条上游引物和探针，对所有下游引物进行筛选，然后根据筛选出来的最优下游引物，筛选其他上游引物，通过比较荧光增量初始时间、荧光增量大小等确定最佳引物探针组合（表1）。采用以上引物探针组合，在相同反应体系和等量模板条件下，确定最佳反应温度为40 ℃。

表1 实时荧光RT-RPA 引物和探针

2.2 特异性试验

以AHSV-VP7、BTV、EHDV、EIV、EIAV、EAV 核酸为模板进行RT-RPA 特异性试验。试验结果（图1）显示，仅AHSV-VP7 出现扩增曲线，其他病毒核酸及阴性和空白对照均未出现扩增曲线，说明本方法特异性强，能准确检测AHSV 核酸，而与其他病原无交叉反应。

2.3 灵敏度试验

选取浓度为2.36×104～2.36×100copies/μL 的AHSV-VP7 核酸作为模板分别进行RT-RPA 试验和实时荧光RT-PCR 试验。试验结果（图2～3）显示，2 种方法的最低检出限均为2.36×101copies/μL，说明本研究建立的RT-RPA 法与WOAH 推荐的实时荧光RT-PCR 法灵敏度相当，且RT-RPA 反应条件简单且无需大型仪器设备，检测时间仅需20 min，适合现场快速检测。

2.4 重复性试验

将浓度为2.36×104、2.36×101、2.36×100copies/μL 的AHSV-VP7 分别用RT-RPA 法 重复检测3 次。结果（图4）显示，2.36×104和2.36×101copies/μL 两个浓度均观察到相应的荧光曲线，表明重复性良好；而2.36×100copies/μL 未出现荧光曲线，再次验证了本方法的最低检测限为2.36×101copies/μL。

2.5 临床样本检测

对临床收集的40 份马血样品和20 份驴血样品分别进行RT-RPA 和实时荧光RT-PCR 检测。结果显示，60 份临床样本的检测结果均为阴性，符合率为100%。

3 讨论

AHS 是所有马疫病中致死率最高的疫病，曾在欧洲和非洲发生过大流行，给当地的养马业造成了严重经济损失，是全球养马业发展最大的潜在威胁[12]。我国虽为AHS 无疫国，但近两年周边临近国家陆续发生AHS 疫情，增大了AHSV 传入我国的风险。2020 年3 月27 日，泰国农业与合作部向WOAH 通报AHS 疫情[13]，此次疫情造成泰国4 个省至少131 例马死亡。2020 年9 月2 日，马来西亚农业与农基产业部向OIE 紧急报告[14]，该国登嘉楼州（Terengganu）发生AHS 疫情。根据农业农村部办公厅关于做好非洲马瘟防范工作的通知[15]，泰国疫情是我国周边国家首次报告的AHS 疫情，最近疫点与我国边境直线距离不足800 km，且我国已监测到AHSV 传播媒介的存在，AHSV 引入风险较高。另外，随着我国对外交流的不断加深和赛马业的蓬勃发展，AHSV 通过跨境比赛马匹、进口种马和马产品等传入我国的风险也在增大。该病目前尚无有效治疗手段，一旦传入我国，不仅会危及到养马业的健康发展，也会带来巨大的经济损失和社会影响。因此，建立一种快捷有效的AHSV 检测方法是防控AHS 的必要措施之一。

与PCR 方法不同，RPA 是一种新型等温核酸扩增技术。该技术反应条件要求低，反应时间短，耗能少且气溶胶污染风险低，是目前动物疫病诊断中应用较为广泛的一种新技术。本研究以AHSVS7基因保守序列为靶基因，设计并筛选出一组特异性引物和探针。试验结果表明：本研究建立的实时荧光RT-RPA 方法特异性好，与其他常见马病病原无交叉反应；灵敏度高，与WOAH 推荐的实时荧光RT-PCR 法灵敏度相当，最低检出限为2.36×101copies/μL；20 min 即可实现AHSV 的快速检测且重复性好。本方法的建立为AHS 防控提供了技术支撑。