固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)调控牛科物种脂合成的研究进展

刀文彬，欧阳依娜,2，哈 福*，苗永旺*

(1.云南农业大学动物科学技术学院,昆明 650201;2.云南省畜牧兽医科学院,昆明 650224)

固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory elemental binding protein，SREBPs)是一种在脂肪与固醇代谢过程中发挥调控作用的蛋白。迄今，已发现的SREBPs家族成员有SREBP1和SREBP2，SREBP1又称为D类碱性螺旋-环-螺旋蛋白1(class D basic helix-loop-helix Protein1，bHLHd1)或固醇调节元件结合转录因子1(sterol regulatory elemental binding transcription factor 1，SREBF1)，SREBP2又称为bHLHd2、SREBF2。SREBP1和SREBP2分别由2个不同的基因编码，且都属于识别固醇调节元件(sterol regulatory element，SRE)的碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链(basic helix-loop-helix-leucine zipper，bHLHzip)转录因子家族的成员，该家族存在于所有真核生物中，是二聚体转录因子最大的家族之一。SREBP1还有SREBP-1a和SREBP-1c两种亚型，SREBP-1c也称为脂肪细胞定向分化因子1(adipocyte determination and differentiation factor-1，ADD1)，是当前研究热点。

Rajavashisth等[1]于1989年发现一种具有手指状结构域的转录因子，能特异性地和固醇调节元件(SRE)(5’-ATCACCCCAC-3’)结合。1993年Briggs等[2]利用离子交换层析和DNA亲和层析等方法从HeLa细胞核中提取一组能和SRE特异结合的蛋白，并且将其命名为SREBPs。SREBP1和SREBP2都具有与SRE和E-BOX基序(5’-ATCACGTGA-3’)双重结合的特异性[3]。SREBP1是调节脂质代谢相关基因表达的关键转录因子，而SREBP2主要参与维持细胞内胆固醇的稳定[4-5]。近年研究表明，SREBPs具有多种生物功能，主要参与生物机体脂代谢、葡萄糖代谢等过程，与牛科物种的体脂、泌乳性状有关。本文在查阅文献的基础上综述了SREBPs的结构与功能、SREBPs参与的生物学路径，并对SREBP1参与牛科动物体脂沉积、乳脂合成的研究工作做了介绍。

1 SREBPs基因的结构及功能

根据美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information，NCBI)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的信息，普通牛(Bostaurus)的SREBP1基因(Gene ID：539361)全长16 214 bp，定位于19号染色体(BTA 19)，具有3个转录本。水牛(Bubalusbubalis)的SREBP1基因(Gene ID：102414468)全长16 177 bp，定位于3号染色体(BBU 3)，具有1个转录本。绵羊(Ovisaries)SREBP1基因(Gene ID：100329218)全长16 112 bp，定位于11号染色体(OAR 11)，具有4个转录本(图1)。以上牛科物种中，SREBP1基因CDS长度大致相同，但不同物种的非翻译区(UTR：5’UTR和3’UTR)有差别，外显子、内含子以及转录本数目不一致(图1)。

根据NCBI数据库的信息，普通牛(Bostaurus)SREBP2基因(Gene ID：507102)定位于5号染色体(BTA 5)，具有一个转录本。水牛(Bubalusbubalis)SREBP2基因(Gene ID：102401994)定位于4号染色体(BBU 4)，具有3个转录本。绵羊(Ovisaries)SREBP2基因(Gene ID：101104393)定位于3号染色体(OAR 3)，具有2个转录本(图2)。以上牛科物种的SREBP2基因CDS长度大致相同，但不同物种间UTR(5’UTR和3’UTR)有差别，外显子、内含子以及转录本数目也不一致(图2)。

由于转录起始位点不同，导致SREBP1基因转录产生SREBP1a和SREBP1c两种亚型。这两种亚型mRNA的第一个外显子区存在差异，在蛋白水平上表现为SREBP-1a比SREBP-1c具有较长的氨基末端(氨基酸数比为42∶24)；此外，在人中还报道SREBP1a和SREBP1c的3’末端存在选择性剪切位点(位于外显子18a、外显子19a或外显子18c、外显子19c处)(图3)，导致SREBP1a和SREBP1c在细胞内对胆固醇消耗反应的前体裂解效率不同[6-7]。暂未见SREBP2基因3’末端具有选择性剪切位点的报道，但SREBP2的氨基末端也比SREBP-1c长[7]。因此，SREBP1和SREBP2因氨基末端转录激活区存在差异，它们具有不同的转录激活作用。

SREBP-1a主要在人工培养的活细胞中发现，SREBP-1c在大多数器官中都表达，如可在成年动物的肝脏中合成，可见SREBP-1c在动物体内起到主导作用。SREBP2既可在人工培养的活细胞表达，也可在大多数组织器官中表达[5,7]。SREBP-1c在激活脂肪酸合成相关基因转录方面具有更强选择性，SREBP-2和SREBP-1a则优先选择调控胆固醇生物合成基因的表达[8]。SREBPs在结构域上具有较大的一致性，包括：(1)由约480个氨基组成的包括bHLH-Zip结构的氨基末端转录活化域；(2)由约80个氨基酸组成的跨膜(内质网膜)且疏水的结构域；(3)由约590个氨基酸组成的羧基末端调节结构域，SREBPs通过该结构域与SCAP结合形成复合体[9](图4)。

近年的研究还发现了SREBPs新的亚型：SREBP1ac和SREBP-2gc。SREBP-1ac能影响SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP2的转录活性[6]，而SREBP-2gc只存在于生精细胞中，它能激活精子形成相关基因的转录[10]。

2 SREBPs参与的生物学路径

SREBPs作为重要的核内发挥功能的转录因子，与众多靶基因一起构成调控网络，参与多条生物学路径。汤晓丽等[11]通过富集分析指出，SREBP1及其直接调控的靶基因在“脂肪酸代谢”、“丙酮酸代谢”和“胆固醇的生物合成”等通路显著富集，但未发现与“细胞的增殖分化”和“凋亡”等通路中的基因富集。另一项研究中，SREBPs在脂质和蛋白质生物合成中起到协助调控的作用，间接对细胞生长和增殖起到调控作用[12]。

2.1 SREBPs的调控机制

SREBPs在固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SREBP cleavage activating protein，SCAP)、胰岛素诱导基因(insulin induced gene，INSIGs)编码蛋白、位点1蛋白水解酶(Site-1 protease，S1P)和位点2蛋白水解酶(Site-2 protease，S2P)4个重要蛋白的参与下，从最初连接在内质网膜(endoplasmic reticulum，ER)上的无活性前体形式，经过蛋白酶水解变成有活性的成熟核型SREBP(nuclear SREBP，nSREBP)，最终到细胞核内发挥转录调控功能[13-14](图5)。新合成的SREBPs前体以发夹的形式突入进内质网内，其羧基端会与起护送作用(护送SREBPs)的SCAP结合，形成紧密相连的SREBP-SACP复合体，由于SCAP能够与INSIG可逆地结合，3个蛋白便形成SREBP-SCAP-INSIG复合体，胆固醇对该复合体的转运有负反馈调节作用[15]。

当胆固醇在细胞内耗尽时，SCAP与INSIG蛋白亲和力减弱，相互分离后，SREBP-SCAP复合体与包被蛋白复合体Ⅱ(coat protein complex Ⅱ，COPⅡ)Sec23/24作用，在内质网以出芽的形式转运到高尔基体膜上，接着被膜上的S1P(一种膜结合型丝氨酸蛋白酶)和S2P(一种含锌金属的膜结合蛋白酶)水解[13]。SREBP被S1P一分为二，剪切成2个跨膜段的大分子，分割位点在2个跨膜部分中间的腔内小环，其中氨基端的bHLH-Zip结构域再被S2P第2次切割后，释放出未含氨基端的bHLH-Zip活性结构域，即被修饰形成有活性的核型SREBP(nSREBP)。nSREBP的bHLH结构域碱性区由15至20个氨基酸组成，该结构域可识别并结合核内相应靶基因的顺式作用元件SREs和E-BOX上[6,16]。

当细胞内胆固醇水平升高时，胆固醇与SREBP-SCAP复合体上SCAP的固醇敏感结构域(sterol sensor domain，SSD)结合后，SCAP构象发生变化，表现为胆固醇超载，COPⅡ不与SCAP结合，这使得SREBP-SCAP-INSIG复合体滞留在内质网上，不参与内质网囊泡的运输，无法发挥复合体的功能，导致靶基因转录停止，胆固醇在体内达到动态平衡[17-19]。此外，当肝脏中SCAP缺乏时，表达胆固醇和脂肪酸合成的基因会减少，导致胆固醇和脂肪酸合成率下降，S1P的缺乏也能导致胆固醇和脂肪酸合成率下降[7,20]。表明在细胞内，脂肪与固醇代谢过程中，SCAP、INSIG、S1P和S2P 4个蛋白对SREBP活化过程起重要作用。

2.2 SREBPs调控的下游靶基因

nSREBPs进入细胞核后，与相应靶基因的顺式作用元件SREs或E盒结合，从而激活转录过程[6,16]。

2.2.1 SREBP1调控的下游靶基因 目前，研究确定的SREBP1靶基因包括：乙酰辅酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)，脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase，FASN)，低密度脂蛋白受体基因(low density lipoprotein receptor，LDLR)，甲状腺激素应答Spot 14(thyroid hormone responsive，S14)，葡萄糖激酶(glucokinase，GCK)和磷酸烯醇式丙酮酸激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PCK1)等脂肪合成和葡萄糖代谢相关的基因[21-28](图6)。

近年来，随着科技的发展，研究人员得益于应用染色质免疫沉淀芯片(ChIP-chip)技术、结合位点分析(ChIP-seq)技术和新一代测序(Next generation sequencing，NGS)技术，在nSREBP1结合位点的研究中取得了巨大的突破，全基因组内已发现上百个nSREBP-1能调控的候选基因[30-32]。通过整合ChIP-seq和差异表达数据，可将SREBP1调控的基因分为3类模型：SREBP1直接调控的靶基因模型、SREBP1间接或远程调控的基因模型和SREBP1可能调控的靶基因模型[11,29]。

2.2.2 SREBP2调控的下游靶基因 在哺乳动物代谢过程中，肝细胞内胆固醇的代谢存在积累和消耗的动态平衡过程。目前，研究较为明确的SREBP2靶基因包括：低密度脂蛋白受体(LDLR)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase，HMGCR)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶1(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coA-synthase 1，HMGCS1)、枯草溶菌素转化酶9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，Pcsk9)和甲基固醇单加氧酶1(methylsterol monoxygenase 1，SC4MOL)等[33-35]。这些基因均与牛科物种胆固醇的摄取和生物合成有关。

2.3 SREBPs转录的调控

在体内，SREBPs的剪切加工和表达调控是一个复杂的过程[36]。对SREBPs的调控主要在转录、转录后2个水平进行[37-38]，构成了错综复杂而又严密的调控网络，维持了机体脂质代谢平衡。SREBP1缺失后其功能可由SREBP2代偿性弥补，但目前尚未发现存在补偿机制可以弥补SREBP2的缺失[39]。

2.3.1 胰岛素对SREBPs的调控 胰岛素是体内三大物质代谢的关键激素，在维持机体代谢平衡方面起着重要作用。胰岛素信号通路一开始受到胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)和/或IRS-2的酪氨酸磷酸化[40]。IRS被磷酸化后对下游的磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)进行激活，PI3K被活化后则催化细胞膜上的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate，PIP2)变成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate，PIP3)[41]。PIP3能与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase，AKT)相互作用[42]。AKT磷酸化雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)后，mTOR通过p70S6K调控特定mRNA的翻译和抑制类脂1(lipin1)间接调控SREBP2的表达[43]。有研究显示，在小鼠肝细胞接触高浓度胰岛素后，SREBP1 mRNA水平在肝细胞中显著下降，而给予禁食处理后，胰岛素水平下降导致肝脏中SREBP1的转录也相应减少[44]，揭示胰岛素能调控SREBP1 mRNA的表达。此外，Peterson等[45]研究表明，mTORC1能通过类脂1来调控nSREBP2的含量。

2.3.2 肝X受体对SREBPs的调控 肝X受体(liver X receptor，LXR)是另一个重要的固醇调控转录因子，包括LXRα和LXRβ两种亚型，属于核激素受体超家族中的一员。LXR被内源性配体氧化固醇或人工合成配体TO901317激活后，能和类视黄醇X受体(retinoid X receptor，RXR)形成异二聚体，再与下游的靶基因启动子区域的特异性反应元件(liver X receptor elements，LXREs)结合，从而调节靶基因的转录。SREBP-1c基因作为LXR靶基因，具有2个LXR应答元件[46]，异二聚体可在SREBPs的转录水平和蛋白质酶解过程进行调节[47]。另一项研究显示，LXR以依赖SREBP1的方式，间接参与山羊(原代)乳腺上皮细胞中脂肪合成相关基因的转录[48]。

2.3.3 AMPK对SREBPs的调控 AMP依赖的活化蛋白激酶(adenosine monophosphate(AMP)activated protein kinase，AMPK)是由1个催化亚基(α)和2个调节亚基(β和γ)组成的一种异源三聚体酶复合物，细胞内能量代谢平衡的关键调节因子[49]。AMPK激活后通过抑制HMG-CoA还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR)的活性来抑制内源性LXR配体的产生，LXR依赖的SREBP-1c转录被抑制，SREBP-1c启动子活性和SREBP-1c mRNA在肝脏中的表达也就降低了[50]。AMPK还可以直接磷酸化SREBP1，抑制SREBP1的酶解和阻止核型nSREBP1转运至细胞核内，间接调控脂肪酸合成相关酶的表达[51]，从而对乳脂代谢过程产生影响。

NAD+依赖的脱乙酰酶(NAD+dependent deacetylase，SIRT1)对细胞能量平衡起到重要作用[52]。用一种从植物中提取的与人类脂联素蛋白在结构和功能上相似的渗透蛋白处理人神经母细胞瘤细胞后，发现该渗透蛋白能够激活AMPK和SIRT1的表达，而SREBP2表达受到抑制[53]，表明AMPK/SIRT1对SREBP2起到负调控作用。

3 SREBP1与体脂沉积

SREBP1基因对牛科物种肝脏、肌肉等部位体脂沉积具有一定的调控作用，但SREBP2基因与牛科物种中体脂沉积的研究还很少。张乐等[54]研究发现，SREBP1基因在荷斯坦奶牛脂肪组织中的相对表达量最高，它也在雪龙黑牛和秦川牛肌肉、肝脏中表达，且在雪龙黑牛肌肉、肝脏中的表达量高于在秦川牛肌肉、肝脏中的表达量。David等[55]研究发现SREBP1在不同牛品种皮下脂肪中的表达量存在差异，Pirenaice牛中的表达量比Salers牛和黑白花—荷斯坦奶牛中的表达量高。这两项研究表明，SREBP1在牛科物种不同组织间对体脂沉积的调控具有差异性。金世杰等[56]研究不同生长阶段(12月、16月和20月龄)延边黄牛肌肉组织中SREBP1基因的表达情况发现，SREBP1基因的表达量在12～20月龄期间与肌间脂肪含量存在正向相关性，且在20月龄时的表达量最高。Deng等[57]通过抑制SREBP-1c基因在体外培养的牛肝细胞中的表达发现，甘油三脂、极低密度脂蛋白等在牛肝细胞中的含量降低，表明SREBP-1c低表达可降低牛肝细胞脂质的合成。SREBP1基因在脂肪沉积中起重要作用，因此，进一步研究SREBP1基因多态性，深入了解它们与牛科物种体脂沉积的关联，具有重要的实践意义。徐丽[58]关于SREBP1基因与雪龙黑牛背膘厚关联分析表明，SREBP1基因第5内含子84 bp缺失与背膘厚显著相关。李海峰等[59]、Hoashi等[60]分别对延边黄牛和日本黑牛SREBP1基因第5内含子84 bp缺失与肌内脂肪组成的研究发现，SREBP1基因的该84 bp缺失与肌内脂肪组成显著相关。

4 SREBP1与乳脂合成

已有研究表明，SREBP1基因与乳脂合成关系密切，但SREBP2基因与牛科物种中乳脂合成的研究也还很少。Bionaz等[61]基于对奶牛不同泌乳时期乳腺中54个与乳脂代谢基因的表达水平分析，构建了乳脂代谢的调控网络图，并提出SREBPs在泌乳过程乳脂代谢网络中处于核心位置。通过对奶牛乳腺上皮细胞(dairy cows mammary epithelial cells，DCMECs)中SREBP1过表达和干扰实验发现，SREBP1是乳脂合成的正调控因子[62]。韩立强等[63]通过亚细胞定位发现，SREBP1蛋白主要存在于乳腺上皮细胞核中，也证实了SREBP1可激活脂肪合成有关基因的转录。乙酰辅酶A合成酶2(acyl-CoA synthetase short chain family member 2，ACSS2)与脂肪酸合成有关。Xu等[64]研究表明，SREBP1可直接与山羊乳腺组织中ACSS2基因的SRE结合，调控ACSS2的表达，进一步间接参与脂肪酸的合成。在另一项研究中，对奶山羊乳腺上皮细胞中SREBP1基因过表达后，发现乳脂合成过程中多个相关基因表达显著提高，同时发现甘油三酯以及硬脂酸(C18∶0)与棕榈酸(C16∶0)在奶山羊乳腺上皮细胞中的含量升高[65]。这两项研究表明，SREBP1对山羊乳脂合成具有重要作用。YAO等[66]将山羊乳腺上皮细胞中的SREBP1基因过表达后发现硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-coenzyme A desaturase 1，SCD1)基因的活性增强，当SREBP1基因被沉默后，这种增强作用就消失了；进一步研究发现，SCD1启动子区域的SRE和核因子Y结合位点缺失后，SREBP1不能使SCD1转录，表明在山羊乳腺细胞中，SREBP1可作用于SCD1来调节脂肪酸组成和甘油三酯合成，进而调控乳脂合成。

以上研究揭示了在牛科物种中，SREBP1对乳脂代谢的核心调控作用。因此，进一步研究SREBP1的遗传变异，分析它们与牛科物种泌乳性状的关联，具有重要的理论和实际意义。在SREBP1多态性分析中，Nafikov等[67]鉴定了SREBP1基因的SNP g.13495T>C，可能与SREBP1基因H1单倍型对牛奶脂肪酸成分和产奶量有关。Rincon等[68]通过对5个群体的423头荷斯坦奶牛，进行SREBP1基因的编码区和保守的非编码区重测序，结果发现SREBP1有6个SNP与乳脂性状相关，它们分别位于19号染色体的第35670891位、35670607位、35671162位、35670811位、35683538位和35684196位，此外，在第14外显子的第66位携带的C/C基因型可导致牛乳脂合成的减少。

5 问题与展望

以往研究结果表明，SREBPs基因在脂质和胆固醇代谢中发挥重要的调控作用。它影响牛科物种肌肉大理石评分、背膘厚、乳脂成分，也与牛科物种脂肪肝等疾病有一定的相关性。但当前仍有一些问题亟待解决：SREBP2代偿SREBP1的具体机制还不清楚；SREBPs作用及调控机制比较复杂，一些详细的机制也不清楚；在牛科物种中SREBPs参与脂质分解的研究比较少；SREBPs基因变异与体脂、泌乳性状的关联性在常见的家养牛科物种中所做的研究不多。因此，从分子水平，有必要深入研究牛科物种SREBPs的作用机制，寻找其重要的功能SNP位点，为牛科家畜体脂、泌乳性状的调控机制的解析及遗传选育奠定基础。