隆林牛与郏县红牛线粒体DNA全基因组遗传多样性比较研究

宣泽义，陈嘉磊，陈少梅，易显凤,3，文信旺,3，肖正中,3，汪燕玲，雷初朝*

(1.广西壮族自治区畜牧研究所,南宁 530001；2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100；3.广西家畜遗传改良重点实验室，南宁 530001；)

在人类文明演进的过程中，牛一直扮演着重要的角色，在古代，牛不仅是食物来源，更是重要的农业生产资料。我国幅员辽阔，自然条件复杂多样，良好的生态环境孕育了极具特色的地方黄牛品种。按照《中国畜禽遗传资源志——牛志》记载，中国目前拥有53个地方黄牛品种[1]。按照地理分布和起源差异，中国黄牛可以分为北方黄牛、中原黄牛和南方黄牛三大类。从牛的起源进化来看，北方黄牛主要是普通牛起源，栖息地在黄河流域以北；南方黄牛以瘤牛起源为主，在中国南方大量分布；中原黄牛则属于普通牛和瘤牛的混合起源，在黄河中下游和淮河流域都有大量分布[2]。

广西壮族自治区地处我国南部，气候温暖湿润，降水充沛，高温持续时间较长。在独特的气候条件和劳动人民的精心选育下，逐渐形成了优良的广西地方黄牛品种—隆林牛。隆林牛中心产区在隆林县境内，在西林县与田林县也有分布[1]。隆林牛体格中等，体躯结构匀称，性情温顺，肌肉饱满，耐粗饲、耐劳，适应性好，肉质细嫩、屠宰率较高，是理想的役肉兼用品种[3]。郏县红牛是中国八大地方良种之一，主要分布在郏县、宝丰、鲁山等县，其体型外貌特征明显，全身被毛多呈红色，具有肉质好、耐粗饲性强和繁殖力高等特点[1]。

线粒体DNA(mtDNA)具有不发生重组、严格遵循母系遗传、多态性丰富等特点，被广泛用于追溯家牛的母系起源和分类研究[4-12]。家牛mtDNA具有丰富的遗传多样性，已经发现7种显著分化的mtDNA支系：包括T1-T5及I1和I2支系[6-12]。Lai等[6]对中国西南地区14个品种共84头黄牛的mtDNA D-loop区进行分析，发现中国黄牛的母系可分为普通牛和瘤牛两大支系。Lei等[7]对231头中国地方黄牛进行mtDNA D-loop区的遗传多样性分析，发现中国黄牛存在4个普通牛支系(T1-T4)和两个瘤牛支系(I1和I2)。Jia等[8]对亚洲6个国家的家牛mtDNA D-loop区序列进行分析，在中国黄牛中检测到亚单倍型组T1A、T3A、T3B和单倍型组T5。Xia等[9]分析了170个“土雷诺-蒙古牛”群体的线粒体DNA基因组数据，发现有普通牛T1-T4支系，并伴有瘤牛I支系及P、Q和牦牛支系。对我国肉牛培育品种云岭牛的mtDNA全基因组分析发现，共有T1-T4、T6和I1、I2共7种支系，证实云岭牛品种具有丰富的线粒体DNA遗传多样性[10]。

目前，仅有郏县红牛mtDNA D-loop区遗传多样性与母系起源的研究[4]，未见郏县红牛mtDNA全基因组序列遗传多样性的报道。尽管Xia等[12]对广西隆林牛、涠洲牛与南丹牛3个地方黄牛品种的mtDNA全基因组进行了分析，但有关隆林牛与郏县红牛mtDNA全基因组的比较研究未见报道。因此，本研究对15头隆林牛和28头郏县红牛的mtDNA全基因组序列进行比较分析，以探究隆林牛和郏县红牛的遗传多样性与母系起源，为隆林牛和郏县红牛的种质资源保护和开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据来源

本研究使用的15头隆林黄牛和28头郏县红牛mtDNA全基因数据来源于本团队的黄牛全基因组重测序原始数据(表1)和已发表的文献[2,11-12]。另外从GenBank下载T1-T5、I1和I2共7个mtDNA全基因组序列(EU177841，AY676856，EU177839，AB074964，EU177862，EU177868，AF492350)作对照，对共计50条mtDNA全基因组序列进行系统分析。

表1 隆林牛与郏县红牛mtDNA基因组的个体号与单倍型

1.2 数据分析

用TRIMMOMATIC软件[13]对隆林牛、郏县红牛和下载的7个牛mtDNA全基因组标准序列数据进行质量控制，使用BWA-MEM软件[14]将质控后的clean reads映射到普通牛参考基因组(ARS-UCD1.2_Btau5.0.1Y;GCF_002263795.1)的线粒体基因组(GenBank：AY526085.1)上，再将BAM比对转化为FASTQ文件，最后使用Mapping Iterative Assembler v1.0 (MIA,https://github.com/mpieva/mapping-iterative-assembler)组装mtDNA基因组序列。

使用DnaSP v5.10软件[15]对所有隆林牛和郏县红牛的mtDNA全基因组序列进行比对分析，并对单倍型和可变位点数目进行统计，确定隆林牛和郏县红牛的单倍型和单倍型组类型，并整理统计相关的遗传多样性参数，如单倍型多样度(Hd)，核苷酸多样度(Pi)和平均核苷酸差异数(K)。利用MEGA 5.0软件[16]对隆林牛和郏县红牛的mtDNA基因组序列进行比对分析，并进行人工校正，构建其mtDNA基因组的单倍型系统发育树(IQ-Tree)。

2 结果与分析

2.1 隆林牛和郏县红牛mtDNA全基因组遗传多样性

使用DnaSPv 5.10软件对15头隆林牛和28头郏县红牛构成的mtDNA全基因组数据集进行比对分析，用以评估其mtDNA的遗传变异情况并追溯母系起源。隆林牛15个mtDNA全基因组序列，定义10种单倍型，郏县红牛28个mtDNA全基因组序列，定义28种单倍型(表2)。隆林牛和郏县红牛43个mtDNA全基因组序列，共定义36种单倍型，其中郏县红牛有26种单倍型；隆林牛仅有8种单倍型，单倍型Hap29和Hap36由2个黄牛品种共享(表1)。隆林牛和郏县红牛mtDNA基因组的遗传多样性和支系组成见表2。

从表2可以看出，郏县红牛的单倍型多样度(Hd±SD)为 1.000±0.010，略高于隆林牛(0.943±0.040)，其核苷酸多样度(Pi±SD)、平均核苷酸变异数(K)也高于隆林牛，说明这2个黄牛品种有丰富的mtDNA遗传多样性，但郏县红牛的遗传多样性更高一些。隆林牛和郏县红牛43个mtDNA全基因组序列的平均单倍型多样度(Hd±SD)为 0.989±0.009，平均核苷酸多样度(Pi±SD)为0.0074±0.0006。

表2 隆林牛与郏县红牛的mtDNA全基因组遗传多样性和支系组成

2.2 隆林牛和郏县红牛mtDNA全基因组系统发育树

使用iTOL v5工具[17]，将7条 T1-T5和I1-2支系的mtDNA全基因组序列，与15头隆林牛和28头郏县红牛定义的36种mtDNA全基因组序列单倍型构建系统发育树(IQ-Tree)(图 1)，发现隆林牛和郏县红牛均有普通牛T支系和瘤牛I支系两大母系起源(表2)，其中T支系拥有16种单倍型，占44%(16/36)，I支系包含20种单倍型，占55%(20/36)。具体来说，28头郏县红牛mtDNA全基因组定义28种单倍型，含有T2、T3、T4及I1支系，分别占3.6%(1/28)、21.4%(6/28)、21.4%(6/28)和53.6%(15/28)，即：T支系占46.4%，I支系占53.6%，表明普通牛与瘤牛对郏县红牛的影响基本一致。15头隆林牛mtDNA全基因组定义10种单倍型，含有T3、T4和I1支系，分别占10%(1/10)、20%(2/10)和70%(7/10)，即：T支系占30%，I支系占70%，表明瘤牛对隆林牛的影响占主导地位。

3 讨 论

家牛mtDNA遗传多样性和系统发育关系的研究，目前大多是针对mtDNA D-loop区进行的[4-8]。隆林牛分布于中国南方瘤牛区，郏县红牛则在普通牛和瘤牛血统较为混杂的中原地区。目前关于中国黄牛mtDNA全基因组遗传多样性的研究不多[9,10,12]。早先对mtDNA D-loop区的研究，证明中国黄牛有普通牛和瘤牛两大母系起源[18,19]。前人的研究发现现代家牛至少有7种mtDNA支系，在非洲分布的主要是T1支系；T2和T3支系主要在近东地区和欧洲大陆；而T4支系为东北亚地区所特有[20]；I1和I2单倍型组则常见于印度次大陆和中国南方黄牛群体[21,19]。本研究对15头隆林牛和28头郏县红牛的mtDNA全基因组序列进行联合分析，共确定36种单倍型，其中隆林牛有8种特有单倍型，郏县红牛有26种特有单倍型。有趣的是，隆林牛和郏县红牛的共享单倍型仅有2种，推测这两个黄牛品种可能在漫长的时间尺度上拥有少量共同母系祖先群体。在隆林牛中发现3个支系：普通牛T3(10%)和T4(20%)支系，瘤牛I1支系(70%)，说明隆林牛的母系起源以瘤牛为主；在郏县红牛中发现4个支系：普通牛T2(3.6%)、T3(21.4%)、T4(21.4%)、瘤牛I1(53.6%)支系，表明普通牛与瘤牛对郏县红牛的母系影响基本一致，这是郏县红牛的显著特点。上述结果表明，这2个地方黄牛品种各自拥有独特的母系遗传信息，表现出明显的母系遗传差异。

本研究发现28头郏县红牛和15头隆林牛的单倍型多样度分别是1.000±0.010和0.0943±0.040，其遗传变异程度均要高于中国地方黄牛的平均水平[18,19,22]，并且郏县红牛的遗传多样性水平相对更高。推测这可能与其所处的地理位置有关，郏县红牛的主产区在中国中部，而中原地区多为普通牛与瘤牛的混合血统，其普通牛与瘤牛的比例基本一致，加上中原开阔的地理位置、良好的生态环境等都为牛种的基因交流带来极大的便利，不同牛种血统的渗入使郏县红牛群体拥有丰富的遗传多样性；相比之下，隆林牛的母系起源以瘤牛为主，普通牛为辅，这是由于隆林牛主产区多为南方山区，潮湿炎热，寄生虫很多，而瘤牛恰恰能耐热抗寄生虫，故隆林牛以瘤牛为主，更能适应当地的环境。隆林牛是广西地区重要的地方黄牛遗传资源，郏县红牛是我国中原地区代表性地方黄牛品种之一。鉴于目前我国政府对畜禽遗传资源高度重视，要求应保尽保。因此，尽管本研究发现隆林牛和郏县红牛mtDNA基因组遗传多样性丰富，但近30年来国外商品肉牛大量与我国地方黄牛品种进行杂交改良，导致我国地方黄牛品种遗传资源持续萎缩和混杂，故对我国地方黄牛品种资源保护的力度还需进一步加大。本研究从母系遗传角度对隆林牛和郏县红牛品种进行了系统评估，为其遗传资源保护提供了科学依据。