穿心莲中药复方对仔猪流行性腹泻的治疗效果及其机制

刘衍芬 ， 瞿健萍

(辽宁农业职业技术学院畜牧兽医学院 ， 辽宁 营口 115009)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是以呕吐、腹泻为主的仔猪疾病，其传播迅速，死亡率高，给养猪业造成巨大经济损失[1-3]。目前防制该病尚无有效的疫苗，治疗方法主要包括返饲、卵黄抗体及中草药治疗等。Liu等[4]采用慢病毒系统将猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV)编码的纤突蛋白主要抗原区(S1)在PK-15细胞中稳定表达，免疫鸡后制备PEDV卵黄抗体(IgY)用于预防和治疗PEDV感染，疗效显著，但制备工艺复杂，成本高。在实际临床中，规模化猪场于PED发病期间采取发病仔猪小肠组织返饲给母猪的方法对该病进行防控，虽然能够显著降低出生仔猪的腹泻率和死亡率，但这一方法容易成为引发猪场其他疫病的高风险因素[5]。

目前，很多研究表明中草药制剂对治疗猪流行性腹泻有显著效果[6-7]。其中，穿心莲具有清热解毒、抗菌消炎、保肝利胆等作用[8]，并可通过影响细胞中Toll样受体3(Toll-like receptor 3，TLR3)的表达，调节其干扰素-β(Interferon-β，IFN-β)的产生，从而提高机体的抗病毒天然免疫功能[9]。而PEDV感染细胞后主要通过抑制干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor 3，IRF3)的产生，干扰TLR3/IFN-β信号通路，导致IFN-β无法产生[10]，造成细胞的抗病毒天然免疫功能受损。穿心莲的功效正与PEDV致病机制形成对抗，推测穿心莲可通过干扰TLR3/IFN-β信号通路转导来发挥抵抗PEDV感染的作用。本试验以穿心莲为主药，配合具有健胃解毒功能的无花果、涩肠止痢功能的大青叶和马齿苋，制备中药复方水煎液，评价其对人工感染PEDV仔猪的治疗效果，旨在探讨穿心莲中药复方(Andrographispaniculatacompound, APC)抗PEDV感染的分子机制，以期为有效防治PEDV感染提供新思路与参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物 以穿心莲为主药，配合无花果、大青叶、马齿苋等，配制中药复方水煎液，经仔猪急性毒性试验证明无毒性作用，经临床治疗试验确定其使用剂量为2 mL/(kg·bw)[11]。杨树花口服液(批号：160602，主要成分杨树花)，购自芮城绿满生物药业有限公司

1.2 试验毒株 PEDV病毒液(CV777株)，由北京伟嘉集团惠赠。

1.3 主要仪器及试剂 生化分析仪，型号为迈瑞BS-120，由迈瑞公司生产；荧光定量PCR仪，型号为BIO-RAD miniQ，由BIO-RAD公司生产。猪流行性腹泻病毒实时定量PCR检测试剂盒(Real PCRTMPEDV RNA Test)，由IDEXX公司生产；DNA Master SYBR Green I荧光定量PCR染料，由Roche公司生产；Advantage®RT-for-PCR 反转录试剂盒，由宝生物工程(大连)有限公司生产；猪Tank 结合激酶1 ELISA试剂盒(Procine TBK-1 ELISA Kit)和猪干扰素-β ELISA试剂盒(Procine IFN-β ELISA Kit)，均由上海酶联生物科技有限公司生产。

1.4 实验动物 经试剂盒检测无PEDV、猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染的健康母猪所产3 日龄体重相同的健康杜洛克×(约克夏×长白)三元杂交仔猪40头，由辽宁农业职业技术学院种猪场提供，采用代乳粉饲喂，受试期间饲养管理条件一致。

1.5 引物 根据NCBI提供序列设计引物，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法扩增猪IRF3、IFN-β和β-actin基因。引物由宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)合成，引物序列信息见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 试验分组与试验设计 将40头3日龄仔猪随机分成4个组，每组10头，分别为穿心莲中药复方治疗组、对照药物治疗组、感染不治疗组和空白对照组。前3组均为PEDV感染组，仔猪均在3日龄时灌服PEDV细胞培养液2.5 mL (106.5TCID50)，空白对照组与其隔离饲养。记录各组出现呕吐或腹泻症状的时间，症状出现后，采样进行PEDV的qRT-PCR检测，结果显示阳性即开始使用药物治疗。穿心莲中药复方治疗组在仔猪发病后经口灌服中药组方水溶液，按2 mL/(kg·bw)，2次/d，连用3 d。对照药物治疗组在仔猪发病后经口灌服杨树花口服液，按照说明书每头口服2.5 mL，1次/d，连用3 d。感染不治疗组不采取任何药物治疗，按2 mL/(kg·bw)灌服生理盐水，2次/d，连用3 d。观察仔猪人工感染PEDV后的临床表现，判定疗效。用药3 d后每组随机选择5头存活仔猪，前腔静脉采集全血10 mL，然后放血致死，无菌采集空肠组织，-20 ℃冻存备用。

1.7 PEDV的qRT-PCR检测 当穿心莲中药复方治疗组、对照药物治疗组、感染不治疗组仔猪被灌服PEDV病毒液12 h后，采集各组仔猪直肠粪便样本，使用试剂盒进行PEDV检测，结果判定：当Ct值<38判定为阳性；当Ct值>38判定为阴性。

1.8 疗效判定 治愈：仔猪呕吐、腹泻停止，食欲恢复至空白对照组，精神状态和粪便恢复正常，血液指标正常。有效：除完全治愈者外，用药后仔猪呕吐、腹泻程度减轻，食欲增强但未达到空白对照组食量。无效或死亡：试验期间经治疗仍无好转或死亡，剖检病变明显且qRT-PCR结果呈阳性。有效率为治疗有效的仔猪头数占所有仔猪头数的百分比。治愈率为治疗痊愈的仔猪头数占所有仔猪头数的百分比。

1.9 生化指标的检测 将采集仔猪全血于3 000 g 离心 5 min后取血清，用生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、肌酸激酶(CK)活性，总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆红素(T-BIL)、血液尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、钙(Ca)、镁(Mg)、磷(PHOS)含量。

1.10 TLR3/IFN-β信号通路关键因子表达水平的检测

1.10.1 样品总RNA提取 按照试剂盒说明书提取空肠组织中的总RNA。

1.10.2 反转录反应 将提取的RNA定量为10 μg(20 μL)，置于PCR反应管中，按照反转录试剂盒操作说明书将空肠组织内总RNA反转录为cDNA。

1.10.3IRF3和INF-β的基因表达水平的检测 采用qRT-PCR法检测，扩增体系(20 μL)：反转录产物1.2 μL，DNA Master SYBR Green I 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，ddH2O 7.6 μL。扩增条件：50 ℃ 5 min； 95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。

1.10.4 qRT-PCR结果数据分析 利用Light-Cycler®96 SW 1.1软件，以β-actin基因为内参基因，进行目的基因 mRNA 表达水平相对定量分析，最后采用 2-ΔΔCt法进行计算，其中：△△Ct=(目的基因Ct-内参基因Ct)穿心莲中药复方治疗组/对照药物治疗组/感染不治疗组-(目的基因Ct-内参基因Ct)空白对照组。

1.10.5 IRF3的蛋白表达水平的检测 采用Western blot法检测，根据 IP 裂解液操作说明书提取仔猪空肠组织中的蛋白，称取1 g组织样品，剪碎，加入含1 mmol/L PMSF的裂解液5 mL，匀浆至充分裂解。12 000 g 离心 5 min，上清液即为组织蛋白样品。将组织蛋白样品与2×SDS 上样缓冲液1∶1 混合后，煮沸 10 min，冰上放置2 min，1 000 r/min 离心5 min，提取样品后用12% SDS-PAGE进行蛋白分离，之后转印到 NC 膜上，进行 Western blot 分析。NC膜用5%的牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1 h后加一抗4 ℃孵育过夜。次日，用 TBST 缓冲液洗涤 3次， 加入二抗，室温孵育1 h，TBST 缓冲液洗涤3次后，ECL 化学发光法检测蛋白的表达。

1.10.6 Tank结合激酶1(Tank binding kinase-1，TBK-1)和INF-β含量的测定 取空肠组织样品5 g研磨后4 ℃ 3 000g离心10 min，取上清，ELISA法测定其中TBK-1和IFN-β的含量，操作按照试剂盒说明书进行。

1.11 数据统计分析 所得数据使用软件SPSS 22.0分析，数据用“平均值±标准差”表示，采用单因素方差分析比较各组的差异。P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 治疗效果

2.1.1 仔猪人工感染PEDV后的临床表现 穿心莲中药复方治疗组、对照药物治疗组和感染不治疗组仔猪均在灌服PEDV病毒液12 h后出现呕吐、黄白色水样腹泻等症状，精神沉郁，食欲下降。感染不治疗组在发病3 d后共出现4头仔猪死亡。空白对照组食欲、精神状态正常，无呕吐、腹泻症状。

2.1.2 PEDV的qRT-PCR检测 穿心莲中药复方治疗组、对照药物治疗组和感染不治疗组仔猪在灌服PEDV病毒液12 h后，采集各组仔猪直肠粪便样本，使用猪流行性腹泻病毒实时定量PCR检测试剂盒对样本进行检测，其结果均为阳性，空白对照组结果为阴性。

2.1.3 穿心莲中药复方治疗PEDV感染的效果 结果如表2所示，穿心莲中药复方治疗组仔猪呕吐、腹泻症状均有明显缓解，食欲上升，有效率达100%；对照药物治疗组有效率为40%；感染不治疗组在人工感染72 h死亡4头仔猪，其他猪只表现出PEDV感染特征症状。经药物治疗后穿心莲中药复方治疗组仔猪PEDV的qRT-PCR检测结果均为阴性；对照药物治疗组仔猪PEDV的qRT-PCR检测结果显示60%为阳性；感染不治疗组仔猪PEDV的qRT-PCR检测结果均为阳性；空白对照组均为阴性。

表2 穿心莲中药复方水煎液治疗效果

2.1.4 穿心莲中药复方治疗PEDV感染仔猪血液生化指标变化 结果如表3所示，穿心莲中药复方治疗组仔猪血清中ALT、AST、ALP含量极显著低于对照药物治疗组、感染不治疗组和空白对照组(P<0.01)，对照药物治疗组TP含量显著低于其他3个组(P<0.05)，感染不治疗组仔猪血清中ALB、GLU含量极显著低于其他3个组(P<0.01)。感染不治疗组血清中T-BIL、CREA、BUN、CK含量极显著高于其他3个组(P<0.01)。穿心莲中药复方治疗组仔猪血清中Ca、PHOS含量与空白对照组差异不显著(P>0.05)，Mg含量极显著高于其他3个组(P<0.01)。

表3 穿心莲中药复方水煎液治疗PEDV感染仔猪血液生化指标变化

2.2 TLR3/IFN-β信号通路相关因子表达水平检测

2.2.1IRF3和INF-β的mRNA表达水平 结果如图1、图2所示，穿心莲中药复方治疗组仔猪空肠组织中IRF3和IFN-β的mRNA表达显著高于对照药物治疗组和感染不治疗组(P<0.01)。感染不治疗组空肠组织中IRF3的mRNA表达显著低于其他3个组(P<0.01)。

图1 穿心莲中药复方水煎液治疗后仔猪空肠组织中IRF3的mRNA表达水平

图2 穿心莲中药复方水煎液治疗后仔猪空肠组织中IFN-β的mRNA表达水平

2.2.2 IRF3的蛋白表达水平 结果如图3所示，穿心莲中药复方治疗组仔猪体空肠组织中IRF-3的蛋白表达水平显著高于对照药物治疗组和感染不治疗组。

图3 穿心莲中药复方水煎液治疗后仔猪空肠组织中IFR3蛋白表达

2.2.3 TBK-1和INF-β的含量 TBK-1结果如图4所示，穿心莲中药复方治疗组仔猪空肠组织中TBK-1的含量明显高于其他3个组，差异极显著(P<0.01)。对照药物治疗组空肠组织中TBK-1含量高于感染不治疗组，低于空白对照组，但差异不显著(P>0.05)。感染不治疗组空肠组织中TBK-1含量与空白对照组相比差异显著(P<0.05)。

图4 穿心莲中药复方水煎液治疗后仔猪空肠组织中TBK-1的含量

INF-β结果如图5所示，穿心莲中药复方治疗组仔猪空肠组织中IFN-β的含量明显高于其他3个组，差异极显著(P<0.01)。对照药物治疗组空肠组织中IFN-β含量低于感染不治疗组，但差异不显著(P>0.05)。感染不治疗组空肠组织中IFN-β含量与空白对照组相比差异显著(P<0.05)。

图5 穿心莲中药复方水煎液治疗后仔猪空肠组织中IFN-β的含量

3 讨论

穿心莲为爵床科植物，味苦、性寒，是一种良好的中药药材，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、解热以及增强免疫等功效，有“中药抗生素”之称[12]。在畜禽养殖生产中，穿心莲经常被用于代替抗生素来治疗疾病。无花果具有健胃消食、止泻痢、治五痔等功效。大青叶、马齿苋具有清热解毒、涩肠止痢的功效。本试验将以上中草药组成复方以治疗PEDV引起的仔猪腹泻。王亚欣等[13]研究发现，复合中草药制剂对猪流行性腹泻具有良好的治疗效果并改善了仔猪生长性能。杨久春等[14]研究中药复方制剂和西药在治疗人工感染PEDV仔猪中的效果，结果发现中药复方对人工感染PEDV仔猪的治疗效果显著，且明显优于西药。李林[6]研究表明中草药复方药剂能有效治疗猪流行性腹泻，提升仔猪存活率，降低死亡风险。在本试验中，穿心莲中草药复方治疗仔猪PED疗效显著，仔猪呕吐、腹泻症状均有明显缓解，食欲上升，有效率达100%，高于对照药物组，且无仔猪死亡，提示该中药复方水煎液能抑制仔猪PEDV的感染。

血液生化指标可反映动物机体的代谢水平、健康状况以及生产性能，大量研究证明，中药复方可有效改善仔猪体内物质代谢水平，提高生产性能和健康状况[15]。卓秀萍等[16]研究发现，感染PEDV仔猪的心脏、肝脏和肾脏功能均受到损害，组织学检查主要表现为心肌细胞水肿，肾小球肿胀，肾实质细胞颗粒变性，肾小管上皮细胞肿胀，肝细胞颗粒变性等。当肝组织发生病变或受到损伤后，肝细胞内的ALT和AST释放到血浆中，引起ALT和AST水平升高。同时，肝细胞过度产生ALP，反流入血液引起ALP升高，T-BIL也会升高。ALB由肝脏产生，为血浆蛋白主要组成部分，其功能为维持血浆胶体渗透压和体内代谢物质转运，当肝脏功能受损时ALB分泌减少。血清中的ALT、AST和ALP常作为肝脏疾病的检查指标。3种酶活性的升高，都代表肝脏受到损害。杜海江[17]研究表明自拟复方中草药超微粉可改善仔猪血液生化指标，增强断奶仔猪血液的抗氧化性，有效降低仔猪疾病的发生。邓文琼[18]研究了穿心莲超微粉对三黄鸡的保健作用及其机理，结果表明，与空白对照组相比，试验第70天时穿心莲超微粉组中的ALT、AST和ALP含量明显降低。本试验结果显示，穿心莲中药复方治疗组仔猪血清中ALT、AST和ALP含量低于对照药物治疗组、感染不治疗组和空白对照组，提示穿心莲中药复方治疗可减轻PEDV造成的肝脏损伤。感染不治疗组仔猪血清中的ALB和GLU含量最低，T-BIL含量最高，这与PEDV感染对肝脏造成损伤的研究结果相符。TP含量高有利于提高代谢水平和免疫力，促进动物机体健康生长。李江北等[19]研究指出，穿心莲内酯干混悬剂显著增加了人工感染大肠埃希菌鸡体内的TP含量。本试验结果显示，穿心莲中药复方治疗组仔猪血清中TP含量最接近空白对照组，提示在治疗PEDV感染的过程中穿心莲中药复方可能在保护肝脏、提高机体免疫机能方面发挥着重要作用。

肾脏是维持体液平衡、维持内环境稳定的关键器官。当肾脏功能受损时，在肾实质受到严重损伤时CREA、BUN含量会急剧上升，体液中的离子将发生变化，可引发低血钙症，磷排泄障碍等问题。本试验中感染不治疗组仔猪的CREA、BUN含量均高于其他组，血液中Ca含量最低，说明其血钙水平低，病情严重，且磷排泄水平降低，证明肾脏在感染PEDV发病的过程中受到损伤。相比较而言，中药复方治疗组Ca、PHOS含量与空白对照组差异不显著，说明该复方对肾脏功能具有保护作用。

血清中的CK活性经常被用来评估心肌损害程度。本试验中与空白对照组相比，穿心莲中药复方治疗组的CK活性更接近于正常值，说明该中药复方可发挥保护心肌的作用，而感染不治疗组心肌损伤最严重。本试验中穿心莲中药复方在治疗PEDV感染仔猪的过程中发挥了调节机体代谢功能，保护肝脏、肾脏和心脏的作用。

一些病毒能够在感染初期通过干扰IFN-β的产生来逃避宿主的免疫应答[20-21]，与PEDV同属冠状病毒科的TGEV感染后可诱导机体产生IFN-β[22]，而PEDV却抑制IFN-β的产生[23]。原因为PEDV在复制过程中产生的dsRNA由TLR3识别并募集β-干扰素TRI结构域衔接蛋白(TRIF)，但此时TBK-1含量和IRF3表达均受到抑制，从而导致IFN-β 表达减少，说明PEDV通过干扰IRF3的活性而阻止了IFN-β的产生，进而逃避宿主的天然免疫机制。杨云乔[24]研究表明中药复方治疗组仔猪空肠组织中IFN-β的mRNA表达水平显著升高。在本试验中，穿心莲中药复方治疗组仔猪空肠组织中IRF3和IFN-β的mRNA表达水平最高，进一步分析穿心莲中药复方水煎液对人工感染PEDV仔猪空肠组织细胞内的IRF-3蛋白表达，发现穿心莲中药复方水煎液能促进IRF-3的蛋白表达。同样，穿心莲中药复方水煎液能促进仔猪空肠组织中TBK-1和IFN-β的分泌，发挥IFN-β的抗病毒天然免疫作用，从而提高穿心莲中药复方水煎液抗PEDV感染的效果。

综上，穿心莲中药复方水煎液可通过调节仔猪机体物质代谢水平、缓解肝脏、肾脏、心脏的损伤；可通过调控机体IRF3的表达来抵抗PEDV感染，削弱PEDV感染对IRF3、TBK-1和IFN-β的表达抑制作用，激发机体抗病毒的天然免疫应答，发挥治疗作用。本试验使用的穿心莲中药复方水煎液为基于中兽医理论指导的整体调理方案，其抗PEDV感染的分子机制的其他信号通路还有待进一步研究。