外源水杨酸对低温胁迫下低温敏感性不同的烤烟品种烟叶生理特性的影响

陈锦芬，侯爽，顾开元，郭金格，汪芬芬，邹聪明，项岩所保，董华，孙浩巍，谢小玉*

农艺与调制

外源水杨酸对低温胁迫下低温敏感性不同的烤烟品种烟叶生理特性的影响

陈锦芬1，侯爽1，顾开元1，郭金格1，汪芬芬1，邹聪明2，项岩所保3，董华3，孙浩巍4，谢小玉1*

1 西南大学农学与生物科技学院，重庆北碚 400715；2 云南省烟草农业科学研究院，云南昆明 657000；3 云南香料烟有限责任公司，云南保山 687800；4云南省烟草质量监督检测站，云南昆明 650106

【】探究低温胁迫下外源水杨酸对低温敏感型不同烤烟品种叶片生理特性的影响，并筛选最佳外源水杨酸的缓解浓度。【】以低温不敏感型品种红花大金元及低温敏感型品种K326为材料，通过盆栽试验研究不同浓度外源水杨酸对4℃低温胁迫下红花大金元和K326叶片相对电导率（REC）、丙二醛（MDA）含量、抗氧化酶活性、渗透调节物质含量及多酚代谢的影响。【】低温胁迫下，2个低温敏感性不同的烤烟品种的相对电导率、丙二醛含量、多酚氧化酶活性及苯丙氨酸解氨酶活性均显著上升，其中，K326的丙二醛含量上升幅度远大于红花大金元，达94.07%；而3个抗氧化酶活性均被显著降低，K326的可溶性糖含量及总酚含量、红花大金元的可溶性蛋白含量均显著上升。施加外源水杨酸后，K326及红花大金元的叶片相对电导率及丙二醛含量均显著降低，而3个抗氧化酶活性及苯丙氨酸解氨酶活性均显著上升，红花大金元的可溶性糖含量及可溶性蛋白含量、K326的总酚含量均显著上升；当外源水杨酸浓度为50～100 mg/L时对各个指标的缓解效果较好。【】外源水杨酸浓度50 mg/L处理对红花大金元及K326的缓解效果均达到最佳。

烤烟；低温胁迫；外源水杨酸；生理特性

低温是影响作物生长发育主要的非生物胁迫之一。低温胁迫会抑制种子出芽、生长及发育[1]，打破光合[2]及抗氧化系统[3]、渗透调节物质的平衡，并降低植株的生物量[4]。烟草是典型的喜温作物，对低温的反应十分灵敏[5]。研究发现，低温胁迫下，烟草幼苗的生长发育及光合作用受到抑制，抗氧化系统被破坏，导致代谢紊乱，造成抗逆性下降[6-7]。此外，若移栽时遭遇极端低温，还会导致烟苗生长缓慢、早花且叶片形状狭长[8]。这些都将导致烟叶的产量及质量受损。因此，研究烟草的抗寒机理，对促进其壮苗的培育及后期产量及品质的提升具有重要意义。

水杨酸是一种小分子酚类物质，也是一种调节植物响应外界胁迫的重要激素[9]。研究发现，水杨酸可以通过抑制活性氧的产生并促进活性氧的清除，以缓解低温胁迫所造成的氧化伤害[10]。但是水杨酸在烟草体内含量很低[11]，故可以通过施加外源水杨酸诱导烟草产生抗逆性[12]。研究发现，外源水杨酸可通过提高蔗糖代谢水平、增强抗氧化酶活性、诱导抗寒基因的表达以及保护细胞超微结构等方式来增强植物的耐寒性[13-15]。

目前，已有许多关于烟草低温胁迫的研究，但是低温胁迫下外源水杨酸对不同抗性烤烟品种叶片生理特性的影响鲜见报道。本研究以低温不敏感型烤烟品种红花大金元及低温敏感型烤烟品种K326为试验材料，采用盆栽试验方法探究低温胁迫对烟草生理特性的影响及外源水杨酸对烟草抗氧化系统、渗透调节物质及多酚代谢的影响，探究外源水杨酸对提高烟草耐寒性的作用，并筛选最适水杨酸浓度，旨在为烟草冷害防控技术提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

以烤烟品种K326（低温敏感型）及红花大金元（以下简称红大，低温不敏感型）为材料，种子由玉溪中烟种子有限责任公司提供。

将种子分别播种于育苗盘中，待长出4片真叶时，选取长势相对一致且健康的烟苗移至高为17 cm、直径为15 cm的花盆中，按照常规管理方法供给水肥。在人工气候培养箱（白天温度为25℃，光照强度为20000 lx，夜间温度为20℃，光照强度为0 lx，光周期为16 h光照/8 h黑暗）养至长出第9片真叶时在培养箱中进行4℃低温胁迫处理3 d，之后采用随机区组法设7个处理（见表1），每个处理3个重复，每个重复3盆烟苗。水杨酸处理组（S1～S5）分别于每天9：00—10：00根施50 mL不同浓度的外源水杨酸溶液，共施3 d；试验对照组（CK）及胁迫对照组（CK0）以等量清水根施。于第7 d上午9：00开始取样。

表1 试验设计

Tab.1 Test design

1.2 取样与测定方法

取样：胁迫处理3 d后，选取各处理长势较为一致的烟株5株，分别选取自上而下的第3片叶剪下用冰盒带回，剪碎混匀后一部分用于相对电导率的测定，另一部分置于液氮中固定片刻后转入超低温冰箱保存并用于生理指标的测定。

相对电导率：称取0.2 g烟叶剪碎置于20 mL去离子水中，真空抽提2～3次，在20℃～25℃恒温下用电导仪测定电导率T1，测完再放入100℃沸水中水浴30 min，取出后自然冷却至室温测定煮后电导率T2，相对电导率（REC）=T1/T2×100%。

生理指标：超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）及苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性，丙二醛（MDA）、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（SP）及总酚（TP）含量的测定均采用相应试剂盒（上海优选生物科技有限公司）测定。

1.3 数据分析

采用软件Excel 2010对数据进行运算和作图，采用SPSS 22.0邓肯氏（Duncan’s）法进行方差分析。采用隶属函数值法对低温胁迫缓解程度进行分析：当缓释剂的施用与该指标测定值呈正相关时，选用公式：Z(i) =（Zi–Zmin）/（Zmax–Zmin），呈负相关时则选用公式：Z(i) =1–（Zi–Zmin）/（Zmax–Zmin）。式中：Z(i)为某系列指标的隶属值，Zi为某系列指标的测定值，Zmax为该系列指标测定的最大值，Zmin则是最小值，最后取所有指标的平均值即为该处理的综合评价值。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫下不同浓度外源水杨酸对烟叶相对电导率及丙二醛含量的影响

图1A表明，4℃低温胁迫下，烟叶的相对电导率显著上升。其中，低温敏感型品种K326显著上升了69.45%，而低温不敏感型品种红大则显著上升了61.10%。施用外源水杨酸以后烟叶的相对电导率下降，当其浓度为50 mg/L时，K326品种的相对电导率降幅最大，较CK0下降了25.84%；当外源水杨酸浓度为100 mg/L时，红大的相对电导率较CK0下降了26.33%，与CK差异不显著。

图1B表明，4℃低温处理使烟叶的丙二醛含量显著增加，K326及红大分别增加了94.07%和41.66%。施用外源水杨酸后K326烟叶的丙二醛含量显著下降，分别较CK0下降了52.95%、52.65%、45.68%、14.77%及12.78%，其中，当水杨酸浓度为10～25 mg/L时缓解效果最好；当外源水杨酸的浓度为25 mg/L时对红大的缓解效果最好，较低温处理显著降低了17.22%。

注：同一图中不同大写字母表示K326的处理差异显著（<0.05），同一图中不同小写字母表示红花大金元的处理差异显著（<0.05），下同。

Note: Different uppercase letters means significant differences at level of＜0.05 in the treatment of K326, while different lowercase letters means significant differences at level of＜0.05 level in the treatment of Hongda, the same below.

图1 低温胁迫下不同浓度外源水杨酸对烟叶相对电导率及丙二醛含量的影响

Fig.1 Effects of different concentrations of SA on REC and MDA of tobacco leaves under low temperature stress

2.2 低温胁迫下不同浓度外源水杨酸对烟叶抗氧化酶活性的影响

图2A表明，低温胁迫下，烟叶的SOD 活性显著下降，K326及红大分别较CK下降了11.78%及14.51%。随着外源水杨酸浓度的上升，烟叶的SOD 活性呈先上升后下降的趋势，当浓度为50 mg/L时，两个品种的SOD活性均达到最高水平，其中，K326较CK0显著上升了30.11%，红大则显著上升了34.50%。

图2B表明，4℃低温胁迫导致K326和红大叶片的POD活性分别显著下降了28.92%及15.83%。施加外源水杨酸可提高POD酶的活性，当其浓度为100～150 mg/L时，缓解效果最佳，其中，K326分别较CK0上升了41.92%和49.62%，红大分别较CK0上升了31.25%及27.10%，差异显著。

图2C表明，4℃低温胁迫下，K326及红大烟叶的CAT酶活性分别下降了25.92%及18.46%。随着根施外源水杨酸浓度的上升，K326的POD酶活性分别较CK0上升了31.92%、69.36%、104.53%、79.17%及37.56%，而红大则分别较CK0 上升了44.02%、83.54%、66.82%、39.43%及26.66%，其中，浓度为50 mg/L的外源水杨酸对K326的CAT酶活性提升幅度最大，而红大则在浓度为25 mg/L时上升幅度最大。

2.3 低温胁迫下不同浓度外源水杨酸对烟叶渗透调节物质含量的影响

图3A表明，4℃低温胁迫下，低温敏感型品种K326烟叶的可溶性糖含量较CK上升了47.71%，差异达显著水平，而不敏感型品种红大烟叶可溶性糖含量虽上升了30.29%但无显著性差异。施用外源水杨酸后，红大的可溶性糖含量持续上升。而K326的可溶性糖含量呈先上升后下降的趋势，当外源水杨酸浓度>10 mg/L时，与CK0无显著差异。其中，当外源水杨酸浓度分别为10 mg/L及25 mg/L时，K326及红大的可溶性糖含量分别升高了25.71%、38.07%，达到最高。

图3B表明，4℃低温胁迫下，低温敏感性品种K326的可溶性蛋白含量与CK相比差异不显著，而低温不敏感型品种红大则显著上升了54.71%。施加外源水杨酸以后烟叶的可溶性蛋白含量上升。随着根施外源水杨酸浓度的上升，红大分别较CK0显著上升了14.32%、37.97%、79.04%、71.63%及60.36%，而K326则分别较CK0上升了23.98%、37.69%、67.94%、57.17%及52.96%。其中，外源水杨酸浓度为50 mg/L时，两个品种的可溶性蛋白含量上升幅度均达到最大。

2.4 低温胁迫下不同浓度外源水杨酸对烟叶多酚代谢的影响

图4A表明，4℃低温胁迫下，烟叶总酚含量升高。当外源水杨酸浓度为50 mg/L时，K326和红大的总酚含量分别增加了9.32%和7.90%达到最高。

图4B、C表明，4℃低温胁迫显著升高了PPO及PAL活性。施加外源水杨酸可继续提高PPO及PAL活性。当外源水杨酸浓度为100 mg/L时，K326和红大的PPO的酶活性分别升高了8.65%、20.22%，PAL的酶活性分别升高了45.38%和36.07%达到最高水平。

2.5 综合评价

通过隶属函数分析（表2）表明，当外源水杨酸浓度为50 mg/L时，两个烤烟品种的缓解效果均达到最佳。

表2 外源水杨酸缓解低温胁迫对不同烤烟品种伤害的综合评价

Tab.2 Comprehensive evaluation of SA in alleviating the injury of different varieties of flue-cured tobacco under low temperature stress

3 讨论

前人研究发现，低温胁迫诱导叶片相对电导率及丙二醛含量显著增加，施用外源缓释剂以后，丙二醛的产生受到抑制，相对电导率也显著降低[16]，这与本试验的研究结果一致。产生这一现象的原因可能是因为低温胁迫导致植物细胞膜脂过氧化，促进了丙二醛的大量产生，而当丙二醛含量在细胞中累积到一定程度时，相对电导率就会上升。此时，外源缓释剂的施加保护了细胞膜的稳定性，维持了细胞结构的完整性[17-18]。本研究发现，低温胁迫对K326的影响大于红花大金元，而在施加外源水杨酸以后，红大烟叶的膜透性也总是小于K326。

低温胁迫对抗氧化酶的活性产生影响，本研究发现，4℃低温胁迫显著降低了SOD、POD、CAT这3个酶的活性，根施水杨酸后酶活性上升，随水杨酸浓度增加呈现先上升后下降的趋势。这与张俊康等[19]及张翔等[14]的研究结果一致。说明重度低温胁迫会导致植物体内的活性氧大量产生，氧化酶的活性在超负荷工作后会降低[20]。而外源水杨酸的缓解效果一是体现在其本身具有清除活性自由基的功能，二是通过提高抗氧化酶的活性和非酶类抗氧化物质的含量来促进活性氧的清除[21]。

植株在受到胁迫时，渗透调节物质含量显著上升[22]。本研究发现，4℃低温胁迫下两个烤烟品种的可溶性糖含量均显著上升，施加外源水杨酸后渗透调节物质的含量进一步提升，可维持胞内较高的渗透压，防止植株因吸水困难而干枯[23]，与杨小环等[24]的研究结果一致。此外，随着外源水杨酸浓度的上升，渗透调节物质的含量均呈现先上升后下降的趋势，这可能是因为水杨酸也是一种植物体内的渗透调节物质，当其浓度太高时，为了保持细胞澎压的稳定，可溶性糖及可溶性蛋白的产生会受到抑制。

已有研究表明，低温处理下植物总酚含量、苯丙氨酸解氨酶及多酚氧化酶的活性会有所上升[25]，与本研究结果一致。但周培禄等[26]却在K326烤烟品种中发现烟叶总酚含量受低温胁迫影响较小。本研究发现，低温胁迫对耐寒品种红花大金元的总酚含量影响较小，但是对低温敏感型品种K326影响较大；施加外源水杨酸后，两个烤烟品种的总酚含量、PAL及PPO的酶活性均有不同程度的提高，说明该举措可能有利于增强烟苗的抗逆能力。

作物的抗寒性受多种因素同时影响，所以需利用多个指标综合评价施加外源水杨酸对烟草的影响。前人研究发现，隶属函数分析法在水稻[27]、棉花[28]、花生[29]等作物抗寒性研究上广为应用，本研究利用隶属函数分析法对两个不同品种烟叶的相对电导率、丙二醛含量、3个抗氧化酶的活性、2个渗透调节物质含量及多酚代谢产物进行综合分析。发现两个烤烟品种施加外源水杨酸以后所表现的抗寒系数具有一致性，均在外源水杨酸浓度为50 mg/L时达到最佳。

4 结论

施加外源水杨酸能显著降低低温胁迫下烟草叶片的相对电导率、抑制丙二醛的产生，增强抗氧化酶活性、提高渗透调节物质，并促进总酚的产生及多酚代谢酶活性的提升。这对于烟草幼苗的低温胁迫有明显的缓解作用。通过隶属函数分析发现，耐寒性品种红大及冷敏感型品种K326均在外源水杨酸浓度为50 mg/L对4℃低温胁迫的缓解效果最佳。

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Effects of exogenous salicylic acid on physiological characteristics of flue-cured tobacco leaves with low temperature sensitivity under low temperature stress

CHEN Jinfen1, HOU Shuang1, GU Kaiyuan1, GUO Jinge1, WANG Fenfen1, ZOU Congming2, XIANGYAN Suobao3, DONG Hua3, SUN Haowei4, XIE Xiaoyu1*

1 College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China;2 Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Kunming 657000, China;3 Yunnan Oriental Tobacco Co., Ltd, Baoshan 687800, China;4 Yunnan Tobacco Quality Inspection & Supervision Station, Kunming 650106, China

This study aims to explore the effects of exogenous salicylic acid on physiological characteristics of flue-cured tobacco leaves with low temperature sensitivity under low temperature stress, and to screen the optimal addition concentration of exogenous salicylic acid.A pot experiment was conducted with cold-tolerant variety Hongda and cold-sensitive variety K326 as materials. The effects of different concentrations of exogenous salicylic acid on relative electrical conductivity, malondialdehyde content, antioxidant enzyme activity, osmotic regulation substance content and polyphenol metabolism of tobacco leaves under low temperature stress at 4 ℃ were studied.The results showed that low temperature stress significantly increased relative electrical conductivity, malondialdehyde content, activity of PPO and PAL, and decreased antioxidant enzyme activity. Among them, the content of MDA in flue-cured tobacco variety K326 increased significantly by 94.07%,which was significantly higher than that of Hongda. Then, the contents of soluble sugar and total phenol of K326 and the Hongda’ssoluble protein content were increased significantly. After the application of exogenous salicylic acid, the relative conductivity and MDA content decreased significantly, while the activities of three antioxidant enzymes and PAL increased significantly. The contents of soluble sugar and soluble protein of Hongda and the total phenol content of K326 increased significantly. When the concentration of exogenous salicylic acid was 50～100 mg/L, the remission effect were better.When the concentration of exogenous salicylic acid was 50mg/L, the mitigation effect on the two varieties was the best.

flue-cured tobacco; low temperature stress; exogenous salicylic acid; physiological characteristics

Corresponding author. Email：xiexy8009@163.com

云南省烟草公司科技计划重点项目“烤烟养分调控与烘烤特性相关性研究”（2020530000241025）；云南省技术创新人才项目（2019HB068）；云南省万人计划（YNWR-QNBJ-2018-400）

陈锦芬（1996—），硕士研究生，主要从事植物生理与分子生物学研究，Tel：023-68251264，Email：1252440242@qq.com

谢小玉（1968—），博士，教授，主要从事植物生理与分子生物学研究，Tel：023-68251264，Email：xiexy8009@163.com

2021-11-08；

2022-02-21

陈锦芬，侯爽，顾开元，等.外源水杨酸对低温胁迫下低温敏感性不同的烤烟品种烟叶生理特性的影响[J]. 中国烟草学报，2022，28（3）.CHEN Jinfen, HOU Shuang, GU Kaiyuan, et al. Effects of exogenous salicylic acid on physiological characteristics of flue-cured tobacco leaves with low temperature sensitivity under low temperature stress[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022,28(3). doi:10.16472/ j.chinatobacco. 2021.218