利用CRISPR/Cas9技术创制香糯型粳稻种质

邹德堂，韩政宏，郑洪亮，徐善斌，姜兴东，王敬国，刘化龙，杨洛淼，贾 琰，辛 威

（东北农业大学寒地粮食作物种质创新与生理生态教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

水稻是世界范围内主要粮食作物之一，全世界约有一半以上人口以大米为主食[1]。随着生活水平提高，人们对稻米的需求不再局限于产量，消费者对稻米品质要求也越来越高。香味和直链淀粉含量是衡量稻米品质重要标准，改良稻米香味和直链淀粉含量已成为水稻育种重要目标之一[2]。传统育种方法主要是通过杂交、回交方式将目的基因转入受体材料，实现优良基因聚合[3]。但这种方法比较耗时，且存在基因之间连锁难题[4]。利用基因编辑技术对基因组进行定点修饰，可简捷、方便、高效实现水稻品种改良。CRISPR/Cas9 是近年兴起的一种新型基因编辑系统，由微生物适应性免疫系统发展而来[5]，随着CRISPR/Cas9 系统逐步发展和完善，该技术已广泛应用于水稻遗传育种。

稻米香味主要由水稻第8 号染色体隐性基因Badh2 控制[6]，该基因编码一种由503 个氨基酸组成的甜菜碱醛脱氢酶（BADH2）[7]。Buttery等研究表明，稻米中香味主要来源于2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP），2-AP合成前体是4-氨基丁醛[8]。在非香型水稻品种中，甜菜碱醛脱氢酶催化4-氨基丁醛氧化，抑制2-AP 合成，稻米不具有香味。当Badh2 基因突变导致功能丧失后，4-氨基丁醛未被催化氧化，促进2-AP合成，使稻米产生香味。

淀粉是稻米胚乳中主要成分，主要包括直链淀粉和支链淀粉，其中直链淀粉含量（AC）是影响稻米蒸煮食味品质（ECQ）关键因素[9]。直链淀粉合成由颗粒结合淀粉合酶（GBSS 蛋白）催化，该酶由Waxy（Wx）基因编码[10]，因此Wx基因座变异较大程度上决定AC 水平多样性，前人研究中发现多种Wx自然等位基因，包括Wxa、Wxb、Wxin、Wxlv、Wxmp、Wxmq、Wxop/hp、Wxmw/la和wx 等[10-12]。其中，等位基因wx是由Wx突变产生的一种糯性突变类型。非糯品种Wx 等位基因主要为Wxa和Wxb，在籼稻中，由Wxa控制高AC（25%～30%）合成，而粳稻以等位基因Wxb为主，AC 较低（15%～18%）。随着消费者需求多样化，通过调控水稻籽粒中AC 改良稻米EQC，已成为近年水稻育种新方向。

本研究以高产、高抗、优质非香非糯性粳稻品种唯农208 为研究材料，利用CRISPR/Cas9 技术同时敲除Badh2 和Wx，通过筛选得到无转基因成分且兼具香味和糯性的香糯型粳稻种质，推动新型粳稻种质选育进程。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受体材料

本研究以高产、高抗、优质非香非糯性粳稻品种唯农208为试验材料。

1.1.2 载体

试验所用载体pYL-U3-gRNA、pYL-U6agRNA 和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H 双元载体由华南农业大学刘耀光院士惠赠。

1.2 敲除靶点设计及载体构建

通 过NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获 得Badh2（Os08g0424500）、Wx（Os06g0133000）基因序列，利用CRISPR-GE 在线网站[13]（http://skl.scau.edu.cn/）“CRISPR Primer Designer”模块设计Badh2和Wx 基因靶序列，在Badh2 第7 外显子设计1 对靶点及接头引物，在Wx 第2 外显子设计1 对靶点及接头引物，两对接头引物分别为T1-F/R、T2-F/R（见表1）。并利用NCBI网站上BLAST程序进行筛选，未找到脱靶序列。

参照Ma 等方法构建Badh2-Wx 双基因敲除载体[14]。

1.3 质粒扩繁及阳性克隆筛选

将构建后载体通过热激法转入Mach1-T1 感受态大肠杆菌中，涂板培养并挑取单菌落作PCR 检测，选取阳性菌落摇菌后提取质粒，随后用AscxⅠ内切酶对质粒进行酶切检测，将酶切检测无误质粒通过热激法转入到EHA105农杆菌中。

1.4 T0代植株获得及突变类型分析

通过农杆菌介导法将CRISPR/Cas9表达载体转入粳稻品种唯农208愈伤组织，采用潮霉素筛选出阳性愈伤组织并分化成T0代植株。采用CTAB法提取T0代植株基因组DNA[15]，以潮霉素基因特异性引物Hyg F/R作PCR扩增，检测阳性植株，并设计引物Badh2-seq-F/R 和Wx-seq-F/R（见表1），分别扩增Badh2 和Wx基因靶点及其附近序列，对所有转基因阳性植株作PCR 扩增，PCR 产物送至擎科生物技术有限公司（北京）测序，测序结果使用兼并序列解码（DSDecode）方法进行分析[16]。

表1 研究使用引物Table 1 Primers used in this study

1.5 T1代纯合突变及无T-DNA原件植株筛选

在T1代植株分蘖期，取叶片提取基因组DNA，利用Badh2-seq-F/R和Wx-seq-F/R引物PCR测序，筛选纯合突变植株，再利用Hyg-F和Hyg-R引物在纯合植株中筛选无T-DNA元件插入的植株。

1.6 T2代纯合无T-DNA元件株系获得

于成熟期收获T1代纯合突变且无T-DNA 元件植株种子，在大田环境下扩繁至T2代，调查农艺性状。利用SPSS 18.0软件分析数据。

1.7 香味测定

采用气相色谱-质谱联用技术，测定并分析水稻籽粒中2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量。利用SPSS 18.0软件分析数据。

1.8 直链淀粉含量测定

直链淀粉含量测定采用分光光度计分析法。利用SPSS 18.0软件分析数据。

2 结果与分析

2.1 水稻Badh2和Wx敲除靶点设计

本研究在Badh2 第7 外显子设计1 对gRNA 靶点接头引物，在Wx第2外显子处设计1对gRNA靶点接头引物，具体靶点信息见图1。

2.2 Badh2和Wx基因表达载体构建

利用“金门”克隆法将带有靶点gRNA 连接到Cas9 载体骨架上，构建后载体即为pYLCRISPR/Cas9-Badh2-Wx-gRNA载体（见图2）。

2.3 T0代转基因阳性苗获得

利用转入pYLCRISPR/Cas9-Badh2-Wx-RNA载体的农杆菌侵染粳稻品种唯农208愈伤组织。在T0代突变体植株成熟时，提取基因组DNA，运用载体特异性引物Hyg-F/R 进行PCR 检测，筛选阳性植株。结果表明，共获得转入pYLCRISPR/Cas9-Badh2-Wx-RNA载体阳性植株42株。

2.4 T0代突变体Badh2 和Wx 基因靶点突变类型分析

对已筛选阳性植株，利用引物Badh2-seq-F/R和Wx-seq-F/R进行PCR 扩增并测序分析，结果表明，42 株阳性植株中有34 株突变植株，其中Badh2 基因突变植株有17 株，Wx基因突变植株有23株，Badh2和Wx均突变植株有6株（见表2）。

图1 Wx和Badh2基因结构及靶点位置Fig.1 Gene structure and target site of Wx and Badh2

图2 pYLCRISPR/Cas9-Badh2-Wx-gRNA载体Fig.2 pYLCRISPR/Cas9-Badh2-Wx-gRNA vector

表2 T0代植株测序结果Table 2 Sequencing results of T0 generation plants

2.5 T1代纯合无T-DNA元件植株筛选

在T1代利用引物Badh2-seq-F/R、Wx-seq-F/R和HygF/R 进行PCR 扩增并测序。通过测序及筛选共得到Badh2和Wx双基因纯合突变且无T-DNA元件植株8株，包含4种不同基因型，相同基因型作为同一株系，将其重新命名为bw-1、bw-2、bw-3和bw-4，测序结果见图3。

2.6 农艺性状测定

测定野生型唯农208 与4 个T2代株系株高、穗数、每穗粒数、结实率和千粒重。结果表明，4个T2代株系与野生型相比，株高、穗数、每穗粒数、结实率无明显变化，而千粒重略降低，但未达到显著水平，整体农艺性状无明显差异（见图4）。说明WX 和Badh2 双基因突变对水稻农艺性状无显著影响。

2.7 香味测定

通过气相色谱-质谱联用技术检测野生型与突变体籽粒中2-AP 含量，测得野生型唯农208 中2-AP含量约为0.065 μg·g-1，而4个突变体株系2-AP含量较野生型均显著增加（见图5），其中BW-1M籽粒中2-AP 含量增至0.504 μg·g-1，高于其他3 个株系；而BW-3M中2-AP含量在4个突变株系中相对较低，2-AP 含量为0.410 μg·g-1。4 个突变株系籽粒中2-AP 含量平均值为0.460 μg·g-1。结果表明，编辑水稻Badh2基因，可获得香味性状明显改良的突变材料。

图3 野生型及T1代纯合突变植株测序结果Fig.3 Sequencing results of wild type and T1 homozygous mutant plants

图4 野生型及突变体农艺性状Fig.4 Agronomic character of wild type and mutant plants

图5 野生型及突变体中香味物质2-AP含量Fig.5 2-acetyl-1-pyrroline(2-AP)content of wild type and mutant plants

2.8 直链淀粉含量测定

将野生型与突变体籽粒脱壳，鉴定糙米表观形态（见图6）。结果表明，突变株系糙米具有蜡质外观，乳白色且完全不透明，与野生型唯农208呈现的典型非蜡质、半透明外观形成鲜明对比。野生型唯农208与4个突变株系直链淀粉含量测定结果见图7，所有突变株系直链淀粉含量与野生型相比均显著下降。由17.0%下降至1.52%～1.83%，呈糯性。表型鉴定结果与直链淀粉含量测定结果均证实对Wx基因成功编辑。

图6 野生型和突变体糙米表型Fig.6 Phenotype of brown rice about wild type and mutants

图7 野生型及突变体中直链淀粉含量Fig.7 Amylose content of wild type and mutant plants

3 讨论与结论

与传统育种相比，基因编辑技术可缩短育种年限，且克服不利基因连锁等难题。CRISPR/Cas9技术作为继ZFN 和TALEN 技术之后第三代基因编辑技术，成本更低且操作更简单，广泛应用于多种作物遗传育种[17-19]。本试验在水稻Badh2 第7 外显子和Wx 第2 外显子分别设计两条sgRNA 靶序列，构建靶向Badh2 和Wx 基因CRISPR/Cas9 敲除载体，以唯农208 为受体材料，突变序列分析表明，CRISPR/Cas9在这两个靶点均具有相对较高的基因编辑效率，Badh2 靶点突变类型以1 和5 bp 碱基缺失为主，多数突变仅在靶点前3 bp处缺失1个胞嘧啶。Wx 靶点产生的突变类型主要为1 bp 碱基插入和3 bp碱基缺失。吴明基等在Badh2第1外显子设计1 个靶点构建CRISPR/Cas9 载体，对水稻品种龙稻18 进行基因编辑，在T1代获得7 种不同纯合Badh2突变基因型[20]。而本试验中，两个基因不同突变类型较少，可能与针对单一基因设计的靶点数目以及靶点序列特征有关。本试验得到42 株T0代阳性植株，其中34 株为阳性突变植株，突变率高达81.0%，表明本试验设计的两个靶点有较高基因编辑效率。方加海等研究认为，靶序列中CG含量对突变效率有影响[21]，这可能是本试验中T0代阳性植株中突变率较高的因素之一。

稻米香味性状是近年育种家关注热点之一。Shan 等利用TALEN 技术对水稻品种日本晴Badh2进行基因编辑，得到Badh2 基因功能缺失突变体，突变体籽粒香味得到明显改良[22]。祁永斌等利用CRISPR-Cas9技术对水稻香味基因Badh2进行定向编辑，得到多个香味改良且无转基因成分纯合水稻株系[23]。孙慧宇等采用咀嚼法和氢氧化钾浸泡法检测Badh2基因编辑突变体籽粒香味[24]。用咀嚼法和氢氧化钾浸泡法测定香味，主观干扰性较大，可能对结果准确性有影响。徐善斌等[25]与周俊飞等[26]使用气相色谱-质谱联用技术测定2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量检测突变体香味，与本文所用方法一致，能够有效避免上述问题出现。

Wx 是水稻直链淀粉含量主效QTL，基因编辑技术之前，主要通过反义RNA或RNAi技术降低水稻籽粒中直链淀粉含量，实现稻米淀粉品质改良。陈刚等将反义Wx 基因转入武运粳7 号，直链淀粉含量显著降低[27]。方加海等利用转反义Wx 基因导入水稻品种珍汕97B，并通过单株选择、回交转育等方法，得到遗传稳定且直链淀粉显著下降的改良水稻品系[21]。本研究利用CRISPR-Cas9技术对唯农208 的Wx 基因进行定点编辑，得到直链淀粉含量显著降低的突变体材料。与传统转基因技术相比，CRISPR-Cas9 技术可精准高效进行基因编辑，且可相对直观地从基因序列中体现出基因突变情况，因此该技术在稻米直链淀粉含量的改良育种中得到广泛应用。汪秉琨等利用CRISPR/Cas9系统以楚粳27为受体材料，在Wx基因第一和第二外显子设计靶点，突变体稻米直链淀粉含量显著降低，由原来17.50%降低至1.93%[28]。本试验以唯农208 为受体材料，对Wx 基因第二外显子进行编辑，筛选得到4个株系直链淀粉含量由17.0%降低至1.52%～1.83%，表现为糯性。结合前人结果表明，对Wx基因进行编辑可显著降低稻米籽粒直链淀粉含量，而直接编辑Wx编码序列，可获得糯性突变材料，实现新型糯稻种质创制。