囊膜蛋白的糖基化修饰对病毒感染和致病性影响的研究进展

赵小天，袁梦淇，张 新，杨晓柯，马吉飞，李永锋*，仇华吉,*

（1.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069；3.河南科技学院，河南 新乡 453003）

糖基化（Glycosylation）是指蛋白质或脂质在酶的作用下连接糖链的一种修饰形式。作为生物体内最重要的蛋白质翻译后修饰形式之一，糖基化调控了蛋白质在组织和细胞中的定位、功能、活性、寿命和多样性[1-2]。细胞内超过50%的蛋白质均有糖链的修饰，它们参与了包括细胞识别、细胞分化、发育、信号转导、免疫应答等在内的各种重要的生命活动。在多种疾病，如肿瘤、神经退行性疾病、心血管病、代谢性疾病、免疫性疾病及感染性疾病的发生发展中均伴随着蛋白质糖基化异常的发生[3-4]。因此，针对糖链形成、糖链结构和糖链功能等的糖生物学研究已成为当前生命科学中不可忽视的领域。根据结合位点和结构的差异，糖链可分为以下几种类型：（1）连接于天冬酰胺（Asparagine，Asn）残基酰胺氮的N-连接糖链；（2）连接于丝氨酸（Serine，Ser）、苏氨酸（Threonine，Thr）残基羟基氧的O-连接糖链；（3）与磷酸丝氨酸上的磷酸连接的糖链；（4）连接于色氨酸（Tryptophan，Trp）残基上碳的C-连接糖链（很少见）；（5）糖基磷脂酰肌醇化[5]。其中N-连接糖链（或称N-糖基化）在真核生物中广泛存在，也是研究最为深入的一种糖基化方式。

一些病毒具有包裹在衣壳外的一层囊膜，这层囊膜主要来源于宿主细胞膜（磷脂层和膜蛋白），但也包含一些病毒自身的糖蛋白。多数囊膜病毒的囊膜蛋白存在糖基化修饰。在病毒感染宿主细胞的过程中，首先是病毒囊膜表面上的糖蛋白识别并结合宿主表面受体，接着病毒囊膜与宿主细胞膜结合，最后病毒的衣壳和基因组进入宿主细胞，完成感染过程。

1 N-糖基化修饰过程

N-连接的糖链合成起始于内质网（ER），完成于高尔基体。N-糖链合成的第一步是将一个14 糖的核心寡聚糖添加到新形成的特征序列为Asn-X-Ser/Thr（X 代表任何一种氨基酸）多肽链的天冬酰胺上。核心寡聚糖是由两分子N-乙酰葡萄糖胺、九分子甘露糖和三分子葡萄糖依次组成，第一位N-乙酰葡萄糖胺与ER 双脂层膜上的磷酸多萜醇的磷酸基结合，当ER 膜上有新多肽合成时，整个糖链将会一起转移。寡聚糖转移到新生肽以后，在ER 中进一步加工，依次切除三分子葡萄糖和一分子甘露糖。在ER 形成的糖蛋白具有相似的糖链，由顺式面进入高尔基体后，在各扁平膜囊之间的转运过程中，原来糖链上的大部分甘露糖被切除，但又由多种糖基转移酶依次加上了不同类型的糖分子，形成了结构各异的寡糖链。血浆等体液中蛋白质多发生N-糖基化，因此N-糖蛋白又称为血浆型糖蛋白。值得注意的是，病毒蛋白的糖基化途径可能不是严格线性的，而且一些病毒颗粒在糖基化途径中早期发生出芽/易位，这可能也解释了一些病毒糖蛋白上存在异常聚糖的原因[6]。此外，许多病毒糖蛋白不遵循经典的分泌途径。例如，病毒直接从ER 运输到质膜，绕过高尔基体中的聚糖而成熟[7]。

2 囊膜蛋白糖基化与病毒复制

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的主要囊膜蛋白GP5 是一种跨膜蛋白，GP5 蛋白有2～4 个潜在的N-糖基化（N-linked glycosylation，NLG）位点。PRRSV 囊膜蛋白不同的糖基化位点对病毒的复制有不同的影响。（1）GP5 蛋白中N30、N35、N44 和N51 单个糖基化位点的突变并不会影响病毒在细胞中的感染性，但是与野生型（Wild type，WT）病毒相比，当GP5 蛋白的NLG 位点存在多个突变时病毒滴度显著降低[8]；（2）II 型PRRSV FL12 株GP3 蛋白或GP5 蛋白中NLG 位点的突变会严重影响病毒在Marc-145 细胞中的复制[9]；（3）尽管在II 型PRRSV 野毒株（PRRSV-01）和PRRSV FL12 嵌合病毒中的GP3 蛋白和GP5 蛋白无NLG 位点，但其在Marc-145 细胞中的复制效率却提高了[10]。出现这种差异，一种可能的原因是由于NLG 位点被敲除的方式不同所致。因为有报道显示FL12 株GP3 蛋白和GP5 蛋白中的NLG 位点均是通过人工方式从病毒基因组中敲除，并且无其他突变[11]；而在PRRSV-01 和PRRSV FL12 嵌合病毒中的NLG 位点则是发生了自然缺失。另一个原因可能是PRRSV-01 GP3 蛋白和GP5 蛋白NLG 位点被敲除的同时可能还发生了其他代偿性突变，这些突变共同增强了病毒的复制能力（表1）。

表1 不同病毒囊膜蛋白去除糖基化修饰对病毒复制、免疫原性、致病性的影响

同样，神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）蛋白作为流感病毒的一种糖蛋白，在病毒出芽和释放过程中起着重要的作用[12]。在流感病毒A/1933/WSN/H1N1（WSN）株NA 蛋白中NLG 的突变降低了病毒的出芽和复制，尤其是当位于NA蛋白的第219位点的NLG突变显著降低了H1N1流感病毒在体内外的复制[13]。

除此之外，囊膜蛋白糖基化对病毒复制的影响还存在体内外的差异。例如，在体外哺乳动物模型中，囊膜蛋白糖基化不影响寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）在BHK 细胞和Vero 细胞中的复制；然而，囊膜蛋白糖基化的敲除却显著降低了A129 小鼠模型中ZIKV 的复制水平[14]。同样，敲除登革热病毒2 型（DENV-2）囊膜蛋白的N153 糖基化位点抑制了病毒在C6/36 细胞中的复制水平[15-16]，但未影响病毒在埃及伊蚊中的复制[17]。有趣的是在西尼罗河病毒（West nile virus，WNV）中，敲除囊膜蛋白的N154 糖基化位点并不影响病毒在C6/36 细胞中的复制，但显著减少了病毒在库蚊中的传播[18]。而在DENV-2 中敲除囊膜蛋白N67 糖基化位点则会破坏DENV-2 在哺乳动物细胞中产生感染性病毒的能力，但并不会影响病毒在蚊子细胞中的感染性[16-17]。以上结果说明糖基化修饰可以增强病毒体内外的复制。因此，可以突变强毒株蛋白的NLG，使其失去糖基化修饰，从而使突变体病毒在体内外的复制效率降低，进而为以后弱毒疫苗的研究奠定基础，但是要注意并不是所有的糖基化修饰对病毒复制都会起到增强作用，细胞和宿主种类的不同也会使糖基化修饰对病毒在体内外复制水平有所差异。

3 囊膜蛋白糖基化与病毒蛋白的免疫原性

猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）强毒株和兔化弱毒疫苗株（C 株）E2 蛋白分别含有5 个和6个潜在的糖基化位点，其中N986 是兔化弱毒疫苗株所特有的[19]。这些糖基化位点对猪瘟病毒的感染十分重要，如果将它们同时突变，病毒就会失去感染性[20]。有研究显示，CSFV囊膜糖蛋白的糖基化位点在病毒吸附与靶细胞侵入、抗体产生、诱导保护性免疫反应及病毒毒力等方面发挥重要的作用（图1），比如存在于E2 蛋白116 位的NLG 位点在猪瘟病毒毒力减弱方面发挥十分重要的作用，而185 位的NLG 位点对于病毒活性至关重要[21]。

图1 囊膜糖基化去除对病毒复制、致病性、免疫原性的影响

对于许多囊膜病毒如丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）和人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）而言，囊膜蛋白糖基化修饰能够影响可用抗原表位的数量，并调节对抗原的免疫识别，从而影响适应性免疫反应[22]。同样，囊膜蛋白的糖基化修饰也会影响PRRSV 的免疫原性。PRRSV GP5 蛋 白 胞 外 区 存 在3 个NLG 位 点（N34、N44 和N51），而在N34、N51 和N34/51 位点突变的病毒对WT PRRSV 特异性抗体的中和作用敏感性增强。此外，用突变体病毒接种猪诱导了针对突变株和WT PRRSV 高水平的中和抗体（Neutralizing antibodies，NAbs），这表明GP5 蛋白胞外区多糖残基的突变增强了体外病毒对中和抗体的敏感性，进而增强了邻近的中和表位的免疫原性[9]。

PRRSV-01 株GP5 蛋白N51 位NLG 的突变增加了病毒对NAbs 的敏感性，并增强了病毒产生同源NAbs 应答的能力，同时PRRSV-01 株GP3 蛋白中N131 位NLG 的缺失也会导致其对NAbs 敏感性及其应答能力的增强[10]。但是，PRRSV FL12 株GP3 蛋白中N29、N152 和N160 位的突变并不影响病毒对NAbs敏感性及其应答能力[11]。这些结果提示，糖蛋白中特定糖基化位点可能对调节NAbs 诱导的能力很重要，不仅使病毒对抗体的中和产生抵抗力，而且还削弱了病毒诱导NAbs 反应的能力。因此，糖基化位点的去除增强了病毒对抗体中和的敏感性，并增强了病毒在体内诱导NAbs 的能力。在以后的针对病毒疫苗的研发过程中，病毒蛋白糖基化位点或许可以成为一个关键的靶点，通过突变糖基化位点，使病毒蛋白发生/去除糖基化修饰，使其诱导中和抗体的能力增加，进而抵抗病毒的感染。

4 囊膜蛋白糖基化与病毒致病性

ZIKV 的囊膜蛋白作为病毒的主要毒力基因，与病毒的致病性密切相关。研究表明，敲除囊膜蛋白的N154 糖基化位点后ZIKV 对小鼠的神经侵袭力减弱，从而导致致病性减弱，并且减弱了对蚊子的感染能力[14,23]，这是由于4 个氨基酸缺失或N154A 替代而导致囊膜糖基化缺失的ZIKV MR766 株在A129 小鼠的血清和大脑中产生的病毒载量低于糖基化修饰的病毒[23]。同样，与WT 糖基化病毒相比，由于N154Q突变而导致囊膜糖基化缺失的ZIKV 导致A129 小鼠血清中的病毒载量下降[14]。由此推断4 个氨基酸或N154 是病毒毒力因子或病毒囊膜蛋白糖基化修饰的关键位点。

同样，敲除DENV-4 型囊膜蛋白糖基化减弱了病毒对小鼠的神经毒性[24]；敲除日本脑炎病毒（JEV）囊膜蛋白N154 位糖基化后病毒对小鼠的神经毒性和神经侵袭力均减弱[25]；鸭坦布苏病毒（DTMUV）囊膜蛋白N156 位氨基酸定点突变后，减弱了病毒在产蛋鸭中的传播，同时降低了病毒在产蛋鸭外周组织中的载量[26]。敲除Erns 和E2 中特定的糖基化位点也会导致CSFV Brescia 株的毒力减弱[27]。无独有偶，与WT 相比，用WNV 感染幼龄家鸡，在感染非糖基化突变株的小鸡中观察到较低的病毒血症和器官中低水平的病毒[28]。同样，与WT 病毒相比，缺失囊膜糖基化的亚洲和非洲ZIKV 病毒株的组织病毒载量更低[29]。

研究表明，敲除新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）的血凝素-神经氨酸酶（HN）蛋白的NLG，可以导致该病毒在鸡中的毒力减弱从而显著降低病毒的致病力[30]。同样，HA 蛋白aa158 突变对H5N1 流感病毒在小鼠体内的致病性也有重要作用。比如G158N 突变，即在HA 蛋白的aa158～aa160 位引入NLG 时，NLG 将会提高感染哺乳动物细胞中的病毒产量，并加剧宿主对病毒感染的免疫和炎症反应从而增强病毒的致病性[31]。与此不同的是，该糖基化位点的突变仅略微降低了另一种高致病性H5N1 病毒A/鸭子/湖南/49/05 株对小鼠的毒力[32]。因此，推测HA 蛋白的糖基化在病毒对哺乳动物的致病性可能因病毒亚型或毒株的不同而有所差异。以上研究表明，囊膜蛋白糖基化修饰能够增强病毒的致病性，但是这些糖基化修饰如何影响病毒毒力的机制尚不清楚，需要进一步探究。

5 小结与展望

NLG 是一种常见的蛋白翻译后修饰，对蛋白的构象和功能起着重要的作用。对于许多囊膜病毒来说，其囊膜蛋白糖基化会影响病毒的免疫原性、感染性和毒力。但是在囊膜蛋白和NS1 蛋白中同时含有糖基化位点突变的ZIKV 是否比只携带NS1 突变的DENV-2 更稳定，或者编码非糖基化囊膜蛋白和NS1蛋白的病毒（m5MR）中是否存在其他病毒蛋白编码区的补偿突变目前尚不清楚。此外，糖基化修饰是如何影响病毒毒力的机制也不清楚。这些都值得进一步探究，可作为以后研究的方向。根据研究表明，糖基化在病毒复制能力中起到一定的增强作用，但并不是所有的糖基化都会对病毒复制起到增强作用。NLG 位点对病毒复制影响的差异是否是由于NLG 位点被敲除的方式不同所致还需要进一步研究。这些问题的答案将进一步加深人们对囊膜蛋白糖基化修饰影响病毒感染和致病机制的了解，并可能有助于寻找抗病毒的新靶点。

关于蛋白糖基化对病毒毒力影响的报道均是针对病毒的结构蛋白，目前有研究发现非结构蛋白糖基化修饰也会对病毒毒力产生影响，比如ZIKV NS1蛋白。尽管非结构蛋白糖基化修饰背后还有很多复杂和未知的机制有待探索，但它为抗病毒感染、疫苗的研制等方面的研究开创了一个新的思路。相信随着糖组学的出现和糖生物学的全面发展，病毒囊膜蛋白糖基化的研究一定会在抗病毒药物开发和新型疫苗研制方面大有作为。