高效液相色谱-串联质谱法测定福建省中北部海域贝类中的软骨藻酸

田 璐，黄奕雯，黄种持

(1.福建农林大学海洋研究院，福建省海洋生物技术重点实验室，福建 福州 350002；2.福建省渔业资源监测中心，福建 福州 350003)

失忆性贝类毒素(Amnesic shellfish poisoning，ASP)是由多列拟菱形藻(Pseudo-nitzschiaseudonitzsehia)分泌产生的毒素，其引起中毒的成分是软骨藻酸(Domoic acid，DA)[1]。部分浮游植物产生的有毒次生代谢物“藻毒素”，也可以沿食物链传递并在贝类体内积累，称为“贝毒”。人类食用含有大量贝毒的水产品后会引起中毒，甚至死亡[2]。1987年底，加拿大暴发了一种急性疾病，其特征是食用养殖贻贝的人出现胃肠道症状和神经系统异常，事后研究表明引起中毒的活性成分为DA，是一种强有力的兴奋性神经递质[3]。DA的存在可能引起中枢神经系统海马区和丘脑区与记忆有关区域的损伤，从而导致记忆的丧失。经研究发现，摄入15～20 mg DA的人群未受其影响；摄入量为60～110 mg时会引起中度胃肠道症状；摄入量为295 mg时表现出各种严重症状，可见DA的毒性具有剂量效应[4]。对贝体内DA的食用安全性进行研究，发现人类通过膳食可耐受的最大限量为20 mg/kg，因此美国FDA将DA列为严重危害人类健康的四种主要海洋生物毒素之一，加拿大首先制定了DA的安全限量标准为20 μg/g贝肉[5]，欧盟和美国安全标准为20 mg/kg贝肉组织[6]。

福建是贝类养殖大省，贝类质量安全和百姓健康与海洋经济的发展息息相关。近年来，由于沿海特殊的海湾环境、气候条件，以及人类开发活动的加剧，导致福建近岸海域环境不断恶化，赤潮灾害频发，而赤潮毒素通过食物链传递富集至贝类体内，进而危害人类健康。加之养殖贝类品种繁多，生物特性各异，导致贝毒风险隐患复杂难控，食用贝类造成的中毒事件时有发生。在这种形势下，对贝类毒素的分析研究越来越重要。迄今为止，我国国家和行业共颁布的有关检测失忆性贝类毒素的标准有GB/T 5009.198—2003《贝类 记忆丧失性贝类毒素软骨藻酸的测定》、SN/T 1070—2002 《进出口贝类中记忆丧失性贝类毒素检验方法》、SN/T 1867—2007 《进出口贝类中软骨藻酸的检测方法 液相色谱-串联质谱法》和SN/T 2663—2010《贝类中失忆性贝类毒素检验方法 酶联免疫吸附法》。这四个标准已被2016年颁布的GB 5009.198—2016《食品安全国家标准 贝类中失忆性贝类毒素的测定》[7]所替代。

检测DA的主要方法有小鼠生物法(MBA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、毛细管电泳法、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)等[8-12]。Quilliam M A等证明了电喷雾电离-质谱(ESI-MS)技术在检测贝类中DA和其他水产品毒素方面的潜力[13]，除此之外目前已经提出了各种反相/电喷雾电离-质谱(RPLC/ESI-MS)技术检测DA[14-15]。Ciminiello P等提出了一种基于亲水作用液相色谱-质谱(HILIC/MS)检测贝类中DA 的新方法，此方法采用多反应监测采集模式(MRM)，在阳性和阴性实验中DA的最低检测水平分别为63和190 ng/g[16]。Blay P等使用台式Orbitrap系统进行液相色谱-质谱(LC-MS)筛选贝类中常见的多种生物毒素，利用亲水作用色谱(HILIC)可在4 min内分离DA等毒素，检出限为3.4～14 μg/L[17]。国内有学者用液相色谱串联电喷雾离子阱质谱法测定贝类中DA[18]，通过QuEChERS技术结合液相色谱-高分辨质谱测定贝类中DA[19]，将免疫亲和柱净化技术结合高效液相色谱-三重四极杆质谱检测双壳类水产中DA[20]。由于受仪器设备的限制，国家还未颁布使用高效液相色谱-串联质谱法(High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)检测贝类中失忆性贝类毒素的标准。因此，本研究拟应用HPLC-MS/MS技术，参照GB 5009.198—2016《食品安全国家标准 贝类中失忆性贝类毒素的测定》要求，建立贝类体内DA残留的检测方法，为提高我国贝类体内DA的检测技术水平和促进水产品质量安全管理提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LCMS-8050高效液相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司；3-30Ks高速冷冻离心机，德国Sigma公司；电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；Milli-Q Integral 5 超纯水一体化智能系统，美国Millipore公司；超声波清洗器，德国Wiggens公司；涡旋振荡器，德国IKA公司。

软骨藻酸标准品(DA，332±11 μmol/L)、SAX 固相萃取柱(200 mg，6 mL)、甲酸：分析纯，上海安谱实验科技股份有限公司；MAX固相萃取柱(60 mg，3 mL)，美国Waters公司；甲醇、乙腈：色谱纯，MERCK公司。

1.2 样品处理

1.2.1 样品制备

用清水将贝类样品外表彻底洗净，切断闭壳肌，开壳，用水淋洗内部去除泥沙及其他外来物。将闭壳肌和连接在胶合部的组织分开，取出贝肉，沥水5 min，检出碎壳等杂物，将贝肉均质，备用。

1.2.2 样品提取

称取5 g(精确到0.01 g)试样于50 mL离心管中，加入50%甲醇溶液12 mL，涡旋混匀1 min，超声提取10 min，以10 000 r/min离心5 min，移出上清液。残渣再用5 mL 50%甲醇溶液重复提取两次，合并上清液，以50%甲醇溶液定容至25 mL，混匀。再以10 000 r/min离心5 min，取上清液，待净化。

1.2.3 样品净化

准确吸取提取液5 mL于预先活化好的SAX小柱中，控制流出液速度约为每秒1滴，然后用5 mL 10%乙腈溶液淋洗，弃去流出液，用4 mL 0.3%甲酸水溶液洗脱，收集洗脱液，用0.3%甲酸水溶液稀释至4 mL(相当于1 g试样)，混匀后经0.22 μm针筒过滤器过滤，滤液供高效液相色谱-串联质谱测定。

1.2.4 空白基质液

选取空白试样，按照“1.2.1～1.2.3”步骤，得到空白基质液。

1.3 质谱条件

离子源为电喷雾离子源；扫描方式为正离子扫描；雾化气流量3 L/min；加热气流量10 L/min；接口温度300℃；脱溶剂温度526℃；DL温度250℃；加热块温度400℃；干燥气流量10 L/min。

1.4 液相色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18超高压液相色谱柱(2.1×50 mm，1.7 μm)；流速0.3 mL/min；柱温30℃；进样量1 μL。在相同梯度洗脱条件下，分别考察流动相A为甲醇溶液、流动相B为2 mmol/L乙酸铵缓冲溶液(含0.1%甲酸)和流动相A为0.1%甲酸水溶液、流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液对DA响应信号的影响，梯度洗脱见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件

1.5 净化条件及洗脱液选择

分别考察MAX(60 mg，3 mL)和SAX(200 mg，6 mL)两种固相萃取柱的净化效果，以及分别考察0.3%甲酸溶液、1.0%甲酸溶液和5.0%甲酸甲醇溶液从固相萃取柱洗脱DA的效果。将MAX固相萃取柱依次用3 mL甲醇和3 mL水活化，SAX固相萃取柱依次用6 mL甲醇、3 mL水和3 mL50%甲醇溶液活化。在一定体积的 100 μg/L DA标准溶液中加入4倍体积的50%甲醇溶液涡旋混合，准确吸取5 mL混合液，加入预先活化好的MAX和SAX固相萃取柱中，控制流出液速度约为每秒1滴，然后用5 mL 10%乙腈溶液淋洗，弃去流出液，用4 mL不同洗脱液洗脱，收集洗脱液，经0.22 μm针筒过滤器过滤，滤液供HPLC-MS/MS测定。

1.6 基质效应、线性范围和检出限

采用HPLC-MS/MS分析测定时，生物样品中的内源性物质或外源性物质会影响分析物的离子化或去溶剂化过程，使分析物的质谱响应增加或降低，从而产生基质效应[21]。本研究采用计算公式如下：

基质效应(%)=

当基质效应在-20%～20%之间为弱基质效应；在-50%～-20%和20%～50%为中等基质效应；超过-50%或50%为强基质效应[22]。

用空白基质液稀释DA并定容，配制成质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0 μg/L的基质-DA标准系列工作液，利用线性回归分析计算DA线性范围。

方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)通常分别按3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比所对应的样品浓度来确定[23]。

1.7 准确度和精密度

取DA标准溶液加入到5 g空白样品中，使添加水平相当于5.0、12.5、50.0 μg/kg，按“1.2.2～1.2.3”步骤进行样品处理，每个水平平行测定6次，连续测定6 d，计算回收率及日内、日间相对标准偏差(RSD)。

1.8 方法应用

利用本文建立的HPLC-MS/MS法对福州、宁德和莆田3个福建省沿海重点养殖区的136个贝类(包括牡蛎、缢蛏、贻贝、花蛤、鲍、扇贝6种贝类)样品进行DA检测分析。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

软骨藻酸分子式为C15H21NO6，含有氨基和多个羧基，离子化过程容易形成正离子，因此选用ESI+离子源进行分析。用DA的标准溶液通过流动注射分析(FIA)在正离子模式下进行母离子扫描，在已知化合物分子量的基础上，将扫描范围设定在200～500 m/z 之间，选择正离子模式下强度最高的[M+H]+作为母离子。通过产物离子优化，对母离子进行碰撞电离，针对自动搜索的产物离子m/z，在-0.5～+0.5 U的范围内，选择峰强度较大的m/z作为子离子，其中丰度最高的子离子作为定量离子，同时根据响应强弱选择适宜的碰撞能(CE)，见表2。

表2 软骨藻酸母离子、子离子和碰撞能量

2.2 色谱条件优化

在表1梯度洗脱条件下，流动相A为甲醇溶液、流动相B为2 mmol/L乙酸铵缓冲溶液(含0.1%甲酸)组合和流动相A为0.1%甲酸水溶液、流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液组合对DA响应信号的影响结果如图1所示。结果表明，在“2.1”质谱条件下，DA分别在2.1 min和2.3 min出峰，出峰时间相差不大，但后者的响应更高，因此选择0.1%甲酸水溶液(流动相A)和0.1%甲酸乙腈溶液(流动相B)作为流动相进行梯度洗脱。

2.3 净化条件优化

贝类中蛋白质、脂肪等杂质含量较高[24]，要对提取液进行净化以减少基质效应和对HPLC-MS/MS产生的干扰。检测结果发现，用4 mL 0.3%甲酸溶液洗脱，经SAX固相萃取柱净化后，回收率超过80%，而经MAX固相萃取柱净化后无目标峰出现(图2)。

注：A.流动相A为甲醇溶液、流动相B为2 mmol/L乙酸铵缓冲溶液(含0.1%甲酸)；B.流动相A为0.1%甲酸水溶液、流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液。

注：A.SAX固相萃取柱净化；B.MAX固相萃取柱净化。

在确定DA仍吸附在MAX固相萃取柱上后，分别考察了0.3%甲酸溶液、1.0%甲酸溶液和5.0%甲酸甲醇溶液作为洗脱液的洗脱效果，如图3所示。HPLC-MS/MS检测发现，5.0%甲酸甲醇溶液作为洗脱液时有目标峰出现，但回收率仅为10%左右；另外两种洗脱液均未发现目标峰。

因此，选择SAX固相萃取柱进行净化；洗脱液酸性较强，会对质谱产生一定影响，因而选择0.3%甲酸溶液作为洗脱液。

2.4 基质效应、线性范围和检出限

注：A.0.3%甲酸溶液洗脱；B.1.0%甲酸溶液；C.5.0%甲酸甲醇溶液。

本研究中基质效应为-3.4%，DA的响应信号略微降低，属于弱基质效应。为减少基质效应带来的影响，采用空白基质液配制DA标准系列工作液，外标法定量测定。

以目标化合物的浓度为横坐标(x)，定量离子的峰面积响应值为纵坐标(y)进行线性回归分析。在0.5～25.0 μg/L范围内线性关系良好，相关系数(R2)大于0.998，结果见表3。根据信噪比(S/N)≥3和信噪比(S/N)≥10计算检出限(LOD)为1.5 μg/kg，定量限(LOQ)为5 μg/kg。

表3 DA线性范围、线性方程及相关系数

2.5 准确度和精密度

DA的加标回收率和精密度实验结果如表4所示。DA在3个浓度水平的平均回收率为68.7%～92.4%，日内相对标准偏差在5.4%～8.4%之间(n=6)，日间相对标准偏差在3.9%～5.1%之间(n=6)，满足分析要求。

表4 加标回收率和精密度(n=6)

2.6 方法应用

本研究通过HPLC-MS/MS对福州、宁德和莆田3个福建省沿海重点养殖区的136个贝类样品进行DA检测分析，包括牡蛎、缢蛏、贻贝、花蛤、鲍、扇贝6种贝类，检测阳性样品结果见表5。检出DA的样品有27个，检出率为19.9%，检出含量在5.2～406.4 μg/kg之间，未超过欧盟安全标准20 mg/kg。

表5 阳性样品的DA含量

续表5

2.6.1 检出DA的地理分布

福州、宁德和莆田DA的检出率情况见图4、图5，3个海域的检出率在14.7%～25.0%之间，检出率相差不大。其中，福州市平潭县、莆田市秀屿区、城厢区和涵江区未检出；福州市连江县、宁德市福鼎市和莆田市北岸区检出率较高，达到40%及以上；其他县(市、区)检出率相差不大。

2.6.2 检出DA的时间分布

采集的136个贝类样品中，2020年5月采集的有26个，2021年4月有33个，2021年5月有36个，2021年6月有41个。2021年5月检出率为11.1%，比上年同期减少10%。2021年4—6月检出率呈逐渐递增趋势(0%～41.5%)，见图6。

2.6.3 检出DA的品种差异

采集的136个样品中包括牡蛎、缢蛏、贻贝、花蛤、鲍、扇贝6种贝类。由图7可知，DA主要在花蛤、牡蛎和贻贝中检出，检出率为13.6%～35.7%；缢蛏、鲍和扇贝中均未检出DA。

3 讨论

福建省仅2012年至2018年7月就发生赤潮56起[25]，赤潮的频繁暴发，导致我省海域养殖贝类受到不同程度的污染，贝类毒素中毒事件屡次发生：如2011年6月宁德市福鼎、霞浦等地发生震惊全国的食用贻贝中毒事件，造成168人中毒；2014年6月至7月，福州罗源、漳州等地发生织纹螺中毒事件；2015年6月，福建莆田发生织纹螺中毒事件，致使2岁男童留下严重的神经系统后遗症等[26]；2017年漳州、泉州海域发生有毒链状裸甲藻(Gymnodiniumcatenatum)赤潮，致使赤潮影响海域滤食性贝类麻痹性贝毒(Paralytic shellfish poison，PSP)超标，造成多地民众因食用滤食性贝类而发生中毒事件[27]。在这种形势下，对贝类毒素的分析研究越来越重要。

由于受仪器设备的限制，国家还未颁布使用HPLC-MS/MS法检测贝类中失忆性贝类毒素的标准。本研究参照GB 5009.198—2016《食品安全国家标准 贝类中失忆性贝类毒素的测定》，并结合HPLC-MS/MS技术，建立了检测贝类体内DA残留的方法。通过对净化条件的改进、色谱条件和质谱条件的优化，有效解决了样品中杂质对DA检测的影响。DA在0.5～25.0 μg/L范围内线性关系良好，相关系数(R2)大于0.998，检出限(LOD)为1.5 μg/kg，定量限(LOQ)为5 μg/kg。在5.0、12.5、50.0 μg/kg 3个浓度水平下的平均回收率为68.7%～92.4%，日内相对标准偏差在5.4%～8.4%之间(n=6)，日间相对标准偏差在3.9%～5.1%之间(n=6)。LC-MS法DA检出限为3 μg/kg，定量限为10 μg/kg[19]，而本文建立的HPLC-MS/MS方法比常规LC-MS法的进样量低5倍，且灵敏度高2倍，能够有效减少对仪器的污染，更好地净化贝类样品中的脂肪、蛋白质等杂质，消除基质效应，具有快速、高效、高灵敏度和高准确度等优点。

运用建立的方法对福州、宁德、莆田3个重点海域的136个贝类样品进行DA检测。分析发现福建贝类中DA含量总体水平较低，但仍有少量检出，主要在花蛤、牡蛎和贻贝中，含量在5.2～406.4 μg/kg之间，检出率为13.6%～35.7%。有研究表明，通常情况下温度升高会促使更多DA的产生。比如成列拟菱形藻(P.seriata)在4～15℃范围内、多列拟菱形藻(P.australis)在5～25℃范围内、澳洲拟菱形藻在23～30℃范围内，DA的产量会随温度的升高而有所增加[28]，这与本研究2021年4—6月检出率呈逐渐递增趋势(0%～41.5%)检测结果一致。从现有文献报道来看，贝类中存在一定水平的毒素污染。吉薇等从11批次样品中检出9批次有DA积累，检出率为81.8%，其中钝齿短桨蟹中DA含量为18.2 mg/kg，已接近欧盟安全标准[29]。陈西平等在14个批次样品中检出7个样品含有DA，含量在 0.4～8.1 mg/kg，检出率达50%[30]。王恒对采集的13种贝类共39份样品检测，DA检出率为64%[31]。因此要加强对贝类中DA的监测，为我国统一DA安全标准的制定提供参考。

本方法检测低限达到5 μg/kg，且线性关系良好，满足欧盟规定的DA 20 mg/kg安全标准，适用于贝类中DA的日常检测和监控，为相关部门强化贝类质量安全监管、加强贝类风险管控、推动贝类产业健康可持续发展提供参考依据。