T淋巴细胞亚群在脓毒症患者中的表达特点及预后的研究

黄守秋 陈晓兵 李 帆 孙 艳 王言理 孙 文 李小民

脓毒症是机体对各种原因引起的反应失调并伴发多脏器衰竭的一组临床综合征，具有高发生率、高病死率、进展速度快等特点，也是导致各大ICU除心源性疾病外患者死亡的重要原因之一[1，2]。脓毒症的发病机制复杂，其中以炎性因子风暴及免疫紊乱为热点。当病原微生物入侵时，机体会启动固有免疫和适应性免疫系统，中性粒细胞聚集，分泌炎性介质发挥抗炎作用，同时激活T淋巴细胞发挥免疫功能，调动机体的免疫防御机制[3]。近年来有研究发现，脓毒症发生时T细胞发挥重要作用，其中CD4+T细胞亚群占绝大多数，而发挥重要作用主要是其亚群调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)。Treg通过释放TGF-β、IL-10等细胞因子抑制自身反应性T细胞增殖活化，也可通过抑制CD4+T细胞，从而破坏T淋巴细胞和B淋巴细胞来发挥免疫无能和免疫抑制作用。辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)有募集中性粒细胞的功能，分泌IL-17、IL-22、IL-6、TNF-α参与多种炎性反应和免疫性疾病，同时与Treg相互作用，从而维持Th17/Treg的平衡状态[4]。本研究通过研究脓毒症患者T淋巴细胞亚群的分布，以及Th17和Treg细胞及其比值来判断脓毒症的严重程度及预后。

对象与方法

1.对象：选取徐州医科大学附属连云港医院2020年12月～2021年10月收治的63例成年脓毒症患者作为研究对象，最终纳入50例脓毒症患者，患者年龄18～90岁，其中根据脓毒症患者的28天预后，分为存活组(n=33)和死亡组(n=17)。根据收缩压<90mmHg，血乳酸≥2mmol/L或使用血管活性药物，分为脓毒症组(n=15)和脓毒性休克组(n=35)。纳入标准：①年龄≥18岁；②符合脓毒症的诊断标准Sepsis 3.0，即感染+SOFA评分≥2[1,2]。排除标准：①拒绝参加及不符合标准的血样本；②怀孕、哺乳期女性；③24h内死亡或自动出院患者；④资料不完整者；⑤患自身免疫病、肿瘤、HIV及乙型肝炎患者；⑥近3个月使用免疫制剂及激素。本研究经徐州医科大学附属连云港医院医学伦理学委员会批准(伦理审批号：KY2020030402)。

2.收集指标和诊断标准：收集入院患者年龄、性别、感染部位、意识、血压、呼吸、脉率、心率、24h内降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)、白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、血细胞比容、血红蛋白、血小板计数、肌酐、白蛋白、胆红素、血乳酸(Lac)、血pH值、Na+、K+，计算中性粒细胞/淋巴细胞比值(NLR)、血小板/淋巴细胞比值(PLR)、系统免疫炎症指数(SII)、急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)评分、序贯器官衰竭评分(SOFA评分)，使用流式测定Treg、Th17并计算Th17/Treg。

3.方法：采集入组患者的外周血3ml，采用罗氏诊断血气分析仪及配套试剂测定血乳酸水平；采用迈瑞全自动血液分析及配套试剂测定白细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、血小板计数以及CRP，并计算NLR、PLR和SII；采用迈瑞仪器使用金标法检测PCT；采用美国BD公司的FACS CantoTMⅡ流式细胞仪检测Treg、Th17。

结 果

1.不同预后的脓毒症患者的一般临床资料比较：两组患者年龄、血红蛋白、白蛋白、APACHEⅡ评分比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，死亡组SOFA评分明显高于存活组，差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者年龄、性别、感染部位(肺部感染、消化道感染、泌尿道感染、胆道感染、腹腔感染、血源性感染、其他)比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，死亡组脓毒性休克患者人数所占比例明显高于存活组，差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者Lac、CRP、白细胞计数、中性粒细胞计数、血小板计数、Treg比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，死亡组NLR、PLR、SII、PCT、Th17、Th17/Treg明显高于存活组，淋巴细胞计数明显低于存活组，差异均有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

表1 两组患者一般临床资料比较

2.不同预后患者有意义指标的水平分布情况: 脓毒症发生时，NLR、PLR、SOFA评分常用于判断疾病的预后，在以28天死亡为结局时，通过图1和图2的箱形图分析，可以看出脓毒症患者中的存活组和死亡组的NLR、PLR、SII、Th17/Treg、SOFA评分进行组间比较，死亡组均高于存活组，且结合单因素分析，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图1 两组患者各指标水平分布

图2 两组患者SOFA评分的比较

3.脓毒症患者和脓毒性休克患者相关指标比较：两组患者28天病死率结果显示，脓毒性休克组高于脓毒症组，差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者Th17、Treg比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，脓毒性休克组CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、Th17/Treg明显高于脓毒症组，差异均有统计学意义(P<0.05)，详见表2。

表2 两组患者相关指标比较[n(%),M(Q1,Q3)]

4.影响脓毒症患者28天病死率的Logistic回归分析：两组影响脓毒症患者28天死亡Logistic回归分析结果显示，NLR、SOFA评分、Th17/Treg在模型中比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，且均为影响患者死亡的危险因素，详见表3。

表3 影响脓毒症患者28天预后的Logistic回归

5.NLR、SOFA评分、Th17/Treg评估脓毒症患者28天预后的ROC曲线：NLR、SOFA评分、Th17/Treg评估脓毒症患者28天死亡AUC分别为0.749、0.776、0.834，且对应P值均<0.05，说明各指标评估脓毒症患者28天病死率的价值均有统计学意义，详见表4、图3。

图3 各指标诊断脓毒症患者28天预后的ROC曲线

表4 NLR、SOFA评分、Th17/Treg诊断脓毒症患者28天预后的ROC曲线

讨 论

脓毒症发病机制复杂,目前免疫炎性反应紊乱是其关键之一[5,6]。NLR是一种成本低、简便、快速的新型炎性指标。脓毒症发生时，中性粒细胞可以发挥如杀灭细菌、真菌、病毒等病原微生物的重要作用，机体启动防御机制，释放相关炎性介质激活淋巴细胞发挥免疫作用[7]。本研究NLR AUC为0.749(P=0.004)，最佳截断值为27.295，敏感度为64.7%，特异性为90.9%。相关研究表明NLR与危重病患者病死率密切相关，与脓毒症的病情及预后相关，该结论与本研究结果一致[8，9]。Hwang等[10]研究发现，急诊入院时脓毒症患者的NLR与28天病死率相关，NLR的变化可能被证明是一种有价值的预后标志物。Liu等[11]通过对333 例成年脓毒症患者进行前瞻性队列研究发现，NLR水平升高与脓毒症患者的不良预后独立相关。而在一项关于老年脓毒症患者的研究中NLR的AUC为0.689(P=0.012)，最佳截断值为11.82，敏感度为66.67%，特异性为67.74%[12]。

1994年，欧洲重症监护医学协会(ESICM)提出SOFA评分系统，Vincent等[13]回顾性分析了1643例感染患者最初24h的SOFA评分，结果表明，SOFA评分与病死率有很好的相关性。SOFA评分作为一种公认的预测器官功能的量表，常常被用来预测脓毒症的预后，并在预测脓毒症的病死率中具有较好的预测能力[1,14]。Li等[15]进行的一项回顾性研究中显示，生存组和死亡组的SOFA评分比较，差异有统计学意义，死亡组在第28天SOFA评分明显高于存活组，ROC下28天 SOFA评分为0.661，即SOFA评分与快速序贯器官衰竭(qSOFA)评分和逻辑器官功能障碍系统(LODS)两评分系统相比较，SOFA评分在预测脓毒症患者的预后方面更优越，这一结果与本研究相似，SOFA评分阈值为12.5，AUC为0.776，敏感度为58.8%，特异性为87.9%。

在获得性免疫中，T淋巴细胞因数量多发挥着重要作用。T淋巴细胞亚群包括CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞，在某种程度上T淋巴细胞的计数反映机体的免疫状态，通过本研究发现，CD4+T、CD8+T细胞在脓毒症休克组中的数量高于脓毒症组。在T淋巴细胞亚群中研究最多的是CD4+T淋巴细胞亚群的Th17和Treg。Th17主要分泌IL-17、IL-22等细胞因子参与促炎反应，而Treg主要释放IL-10、TGF-β发挥免疫抑制和免疫无能，Th17/Treg平衡在细胞免疫中发挥重要作用[16]。Th17与Treg并非单一通过其各亚群绝对数来代表机体免疫情况，Th17/Treg比例的失衡也与脓毒症的预后存在明显的相关性。Gupta等[17]通过比较创伤后脓毒症患者的Treg变化结果发现，脓毒症休克患者的Th17/Treg比值较单纯脓毒症患者的高，同时其比例与序贯器官衰竭评分也呈强正相关，表明Th17/Treg比例越高，SOFA评分数值越高，脓毒症患者的预后越差[17]。当机体发生脓毒症时，机体处于代偿状态，Th17、Treg均会有升高，主要是Treg，后期病情加重，处于免疫抑制状态，两者仍升高，以Th17为主[21]。有研究显示，脓毒症患者中Th17/Treg随着脓毒症严重程度失衡而进一步加重[18]。本研究显示，Th17/Treg的ROC值为0.834，阈值为0.116，敏感度为82.4%，特异性为85.8%。

目前，脓毒症的预测指标有很多，临床上常将血培养作为其金标准，具有耗费时间长、阳性率低、易出现假阳性的缺点，不易对早期脓毒症做出干预以及改善预后。有研究表明，Th17/Treg的比例失衡与脓毒症的严重程度有关，这与本研究结果基本一致，脓毒症休克组患者T淋巴细胞亚群及Th17/Treg较脓毒症组高，当Th17/Treg>0.116，脓毒症患者病情越重，预后越差[19]。

本研究具有一定的局限性：①该研究为小样本量的前瞻性实验，需要开展大样本量的研究进行验证；②数据在收集过程中存在缺失的可能，进行入组时会有选择偏倚;③早期诊断脓毒症困难，用流式检测对标本要求较高。

综上所述，本研究结果显示，NLR、SOFA评分、Th17/Treg是脓毒症患者28天预后的影响因素，且Th17/Treg与患者病情严重程度及预后有关，可以作为研究脓毒症治疗和判断预后的指标。