不同前处理方法对鱼肉中氯霉素残留检测研究

冯 惠，唐一秋

（昆明市食品药品检验研究院，云南昆明 650000）

氯霉素，化学式为C11H12Cl2N2O5，是一种从委内瑞拉链霉菌中分离出来的广谱抗菌素，易溶于甲醇、乙醇、丙醇和乙酸乙酯，其化学结构含有对硝基苯基、丙二醇和二氯乙酞胺基3个部分[1-3]。氯霉素对许多需氧革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌、立克次氏体、衣原体及菌质体都有抑制作用，尤其对沙门氏菌属、流感杆菌属等有很好的抗菌能力，因此被人们过量使用，导致水产食品及其生活环境中残留有大量的氯霉素[4-6]。食用氯霉素药物残留含量过多的食物会损害人体肝脏以及抑制骨髓的造血功能，呈现出具有可逆性的骨髓抑制作用，如贫血、再生功能障碍性贫血，此外还可能导致鼻出血、高热、咽痛、黄疸、腹胀、腹泻、食欲减退以及恶心、呕吐等病症[7-9]。在水产养殖中过度使用氯霉素，不仅会降低鱼类的免疫力，还会使病原菌有不同程度的抗药性[10]。鱼类在摄入大量氯霉素后，随着血液循环，机体会将其分布到肺、骨等组织器官，削弱其免疫能力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

6 mL Captiva EMR-Lipid小柱（安捷伦）、有机滤膜、注射器、分液漏斗、棕色心形瓶、乙腈（色谱纯）、正己烷（色谱纯）、正丙醇（色谱纯）、乙酸乙酯（色谱纯）、丙酮（分析纯）和氯霉素标准品（100 μg/mL）。

1.2 仪器与设备

液相色谱-串联质谱-质谱仪（AB Triple Quad™ 3500）、旋转蒸发仪（步琦ROTAVAPOR R210）、氮吹仪（睿科Auto EVA）、离心机（贝克曼ALLEGRA X-30R）、天平、均质机和超纯水器。

1.3 色谱条件

色 谱 柱：CAPCELL PAK ADME-HR（2.1 mm× 100 mm，2 μm，）；流动相：流动相A（5 mmol/L乙酸铵），流动相B（乙腈）。

1.4 质谱条件

离子化模式：负离子技术模式（ESI-）；质谱扫描方式：多反应进行监测（MRM）；气帘气（CUR）：35 psi；离子化电压（IS）：-4500 V；离子源温度（TEM）：550 ℃；GS1：50 psi；GS2：50 psi；进样量：3 μL；色谱柱流速：0.3000 mL/min，质谱。

1.5 样品的制备、提取

将所购昆明市市售淡水鱼（新鲜鱼肉）制成碎块，放入冰柜冷冻保存。

1.5.1 实验室优化方法

称样5 g，10 mL乙酸乙酯提取，涡旋振荡5 min，离心10 min，合并上清液，10 mL乙酸乙酯提取残渣，涡旋振荡，离心10 mL，合并上清液，40 ℃旋蒸，6 mL乙腈溶解残渣，加入6 mL乙腈饱和的正己烷振荡，静置，弃上层正己烷，40 ℃旋蒸，5 mL 80%乙腈水溶液溶解残渣，过Lipid除脂小柱，收集滤液，过有机滤膜（0.22 μm），装瓶，待测。

1.5.2 GB/T 22338—2008方法

称样5 g，加入100 μL氯霉素内标液0.2 mL，加入30 mL乙腈，匀浆，离心5 min，收集上清液，加入15 mL乙腈饱和的正己烷，振荡5 min静置分层，乙腈层转移至100 mL棕色鸡心瓶溶解残渣，振摇 3 min，离心5 min。收集上清液，振荡5 min静置分层。乙腈层加5 mL正丙醇，40 ℃旋蒸，5 mL丙酮-正己烷（1+9）溶解残渣，5 mL丙酮-正己烷（1+9）淋洗LC-Si硅胶小柱，残渣溶解液转移至小柱，丙酮-正己烷（6+4）5 mL洗脱收集于鸡心瓶，40 ℃旋蒸， 5 mL水定容，过有机滤膜（0.45 μm）装瓶，待测。

2 结果与分析

2.1 标准溶液的配制

分 别 取 氯 霉 素 标 液（100 ng/mL）0.005 mL、 0.010 mL、0.050 mL、0.100 mL、0.200 mL、0.400 mL、 0.800 mL和1.000 mL，80%乙腈水定容至10 mL，氯霉素标液的浓度为0.05 ng/mL、0.10 ng/mL、 0.50 ng/mL、1.00 ng/mL、2.00 ng/mL、4.00 ng/mL、 8.00 ng/mL和10.00 ng/mL。各个浓度进样3次，按照选定的色谱条件测定，横坐标以各标液的浓度表示，纵坐标以各组分的峰面积表示，以峰面积对浓度做线性回归方程，绘制出各组分的标准工作曲线。氯霉素标准曲线校准曲线公式：f(x)=2513.97864x+ 48.73404，R=0.99922。

2.2 方法的精密度、准确度实验

称取样品5.0 g，分别向样品中加入100 ng/mL的混合标准储备液5 μL、10 μL、50 μL，GB/T 22338—2008方法在加入标准溶液的基础上分别都加入 100 μg/mL氯霉素内标溶液0.02 mL处理样品，采用液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）检测。每个添加浓度分别平行测6次。氯霉素的回收率以各组样品间的测定浓度和加入量的不同来计算，结果见表1。GB/T 22338—2008方法的平均加标回收率在97.9%～105.0%；实验室优化方法的平均加标回收率在90.1%～98.4%。

表1 氯霉素回收率

2.3 基质效应实验

称取鱼肉样品5.0 g，向称取的样品中加入100 ng/mL的混合标准储备液5 μL、10 μL、50 μL，提取处理，采用LC-MS/MS检测，每个添加浓度平行测定3次，氯霉素的回收率以各组样品间的测定浓度和加入量的不同来计算，结果见表2。

表2 氯霉素回收率（不加基质标液）

2.4 检出限与定量限的测定

选取标样（1 ng/mL）连续测定10次，确定其基线噪音值（S/N），计算平均值。按照3倍信噪比来计算其检出限。定量限可用10倍信噪比来计算可得。实验室优化法氯霉素的检出限为0.008 μg/kg，定量限为0.027 μg/kg。国家标准方法氯霉素的检出限为0.015 μg/kg，定量限为0.049 μg/kg。实验室法氯霉素的检出限小于GB/T 22338—2008的检出限，表明此方法灵敏度较高。

3 结论与讨论

通过以上实验过程及实验数据对比，GB/T 22338—2008方法与实验室优化方法二者各自的优缺点见表3。实验室优化后的方法在处理时间、试剂用量、实验步骤和器皿使用上皆少于GB/T 22338—2008方法，且净化效果和灵敏度都优于GB/T 22338—2008方法，从而达到更快速、简捷和经济的目的。

表3 两种方法比较