超高效液相色谱-质谱联用法 测定发酵肉和发酵蔬菜中5种生物胺

虞太六

（上海华测品标检测技术服务有限公司，上海 201112）

生物胺（Biogenic Amines，BAs）广泛存在于各种食品中，且水产品、酒类产品、肉制品和乳制品等一般发酵食品中生物胺含量明显高于非发酵食品[1]。适量生物胺可促进人体的正常生理活动，而过量摄入会产生不良反应。目前，检测食品中生物胺的方法主要有液相色谱法[2]、气相色谱法[3]、薄层色谱法[4]和毛细管电泳法[5]。本文用5%高氯酸冰浴超声提取，离心，取上清液，调节pH并定容，经正己烷净化，建立食品中5种生物胺的高效液相色谱-质谱联用（High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱-串联质谱Wat ers Xevo TQ-S，美国Waters公司；超声波提取器、恒温水浴振荡器、涡旋振荡器，上海安谱实验科技股份有限公司。分析天平，美国Mettler Toledo公司；离心机，湖南湘仪离心机有限公司；离心管，上海安谱实验科技股份有限公司；超纯水仪，美国Millipore公司。

乙腈（HPLC级）、高氯酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、甲酸和甲酸铵（HPLC级）。尸胺、腐胺、酪胺、组胺和色胺标准品，纯度＞98%。

1.2 标准溶液配制

（1）标准储备液的配制（1.0 mg/L）。分别准确称取适量尸胺、腐胺、酪胺、组胺和色胺分别用水溶解并定容至10 mL，配制成浓度为1.0 mg/L的标准品储备液，4 ℃保存，有效期1个月。

（2）混合标准品中间液（尸胺、腐胺和酪胺： 200 μg/mL；组胺和色胺：20 μg/mL）。准确移取尸胺、腐胺和酪胺2 mL，组胺和色胺0.2 mL置于10 mL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，混匀，4 ℃保存，有效期1个月。

（3）混合标准工作液（尸胺、腐胺和酪胺：2 μg/mL； 组胺和色胺：0.2 μg/mL）。取0.1 mL混合标准品中间液置于10 mL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，混匀，4 ℃保存，有效期2周。

（4）准确移取生物胺混合标准工作液（尸胺、腐胺、酪胺浓度为2 μg/mL，组胺和色胺浓度为0.2 μg/mL） 0.050 mL、0.125 mL、0.250 mL、0.500 mL、 1.000 mL、2.500 mL和5.0 mL分别置于10 mL的容量瓶中，用0.5%高氯酸溶液-乙腈溶液（准确量取25 mL 0.5%高氯酸溶液用乙腈定容至100 mL，混匀）稀释并定容，其中尸胺、腐胺和酪胺浓度为 10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、 500 ng/mL和1 000 ng/mL；组胺和色胺浓度为1.0 ng/mL、 2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL和100.0 ng/mL，现配现用。

1.3 样品前处理

称取2 g试样（精确至0.01 g）试样于50 mL刻度离心管中，加入20 mL 5%高氯酸溶液，旋涡 5 min，冰浴超声20 min，5 000 r/min离心10 min，将上清液转移至另一50 mL刻度试管中；样品残渣再加入20 mL 5%高氯酸溶液重复提取一次，合并上清液。往上述上清液中加入适量400 g/L氢氧化钠溶液调节pH至2～3，用0.5%高氯酸溶液定容至 50 mL。取2 mL上述溶液至离心管中，加入2 mL 0.5%高氯酸溶液，加入5 mL正己烷，振荡混匀，离心，弃去正己烷层；再加入5 mL正己烷净化，弃去正己烷层。吸取0.25 mL上述溶液至玻璃管中，加入 0.75 mL乙腈，混匀，过0.22 μm滤膜，供LC-MS/MS测定。

1.4 分析条件

（1）色谱条件。色谱柱：Waters XBridge HILIC色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：A为含10 mmol/L甲酸铵、0.5%甲酸的水溶液，B为含10 mmol/L甲酸铵、0.5%甲酸的乙腈溶液；流速： 0.3 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：2 μL。流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度表

（2）质谱条件。电离源：ESI+；毛细管电压：4.0 kV； 离子源温度：150 ℃；脱溶剂温度：400 ℃；脱溶剂气流量：800 L/h；检测方式：MS/MS，参数见表2。

表2 5种生物胺的MS/MS参数

2 结果与分析

2.1 分析条件优化

2.1.1 方法的线性范围、检出限和定量限

采用内标法定量，分别以3倍和10倍信噪比（S/N）确定目标分析物的检出限和定量限。测得发酵肉和发酵蔬菜中5种BAs的检出限为0.001 60～ 0.002 26 mg/kg，定量限为0.008 21～0.182 00 mg/kg。5种BAs的标准曲线的相关系数均大于0.995。

2.1.2 方法的回收率和精密度

采用空白样品中添加标准溶液的方法，进行添加回收实验，尸胺、腐胺和酪胺添加水平分别为 2 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg，组胺和色胺添加水平分别为0.2 mg/kg、1.0 mg/kg、5.0 mg/kg，按照优化后的方法进行测定，每个质量浓度点平行测定6次，外标法校正。由表3实验数据可知，在添加范围内BAs的平均回收率在79.0%～98.0%，相对标准偏差为0.80%～8.69%。

表3 分析方法的回收率和相对标准偏差

2.1.3 实际样品测定

使用建立的方法对10种发酵肉和10种发酵蔬菜中5种BAs残留进行分析。20个样品的测试结果表明如下。10种发酵肉中尸胺样品浓度为ND～ 152 mg/kg，腐胺样品浓度为ND～96.2 mg/kg，酪胺样品浓度为ND～344 mg/kg，组胺样品浓度为ND～484 mg/kg，色胺样品浓度为ND～39.8 mg/kg。10种发酵蔬菜中尸胺样品浓度为ND～132 mg/kg，腐胺样品浓度为ND～122 mg/kg，酪胺样品浓度为ND～194 mg/kg，组胺样品浓度为ND～55 mg/kg，色胺样品浓度为ND～2.55 mg/kg。

3 结论

本文建立了超高效液相色谱-质谱串联技术测定发酵肉和发酵蔬菜样品中5种BAs残留的分析方法。该方法的线性关系、准确度和精密度均能满足残留分析要求，其前处理方法简单、净化效果良好，适用于大量发酵食品样品中5种BAs含量的快速检测。