液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中 恩诺沙星残留量的不确定度评估

李 苗，代 菲，纪丽君，丁洪流

（苏州市产品质量监督检验院，江苏苏州 215104）

本实验依据《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS—GL06：2006）[2]和《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[1]，参照农业部1077号公告—1—2008 水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法[3]，对LC-MS/MS外标法测定鱼肉中恩诺沙星残留量的不确定进行分析，为实验室内部质量控制提供数据支持，保障实验数据准确性、可靠性。

1 材料与方法

1.1 试剂耗材

标准品：恩诺沙星（美国A Chemtek公司）；甲酸、甲醇、乙腈（色谱纯，美国Merck公司）；无水硫酸钠（650 ℃灼烧4 h，冷却后贮存于密闭容器中备用，分析纯，国药集团试剂有限公司）；实验室用水为Milli-Q超纯水一级水。

1.2 仪器设备

ACQUITY UPLC/TQ-XS液相色谱-串联质谱，美国Waters公司；离心机，艾本德；Multi Reax涡旋 仪，德国海道尔夫公司；超声波清洗仪，德国Elma； 多通道旋蒸仪，德国IKA。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

称取5 g试样于50 mL离心管内，加入10 g无水硫酸钠，涡旋混匀，再加入于20 mL酸化乙腈，涡旋混合，超声提取10 min。以4 000 r/min离心 5 min，取上清液于梨形瓶中。残渣中再加入20 mL酸化乙腈溶液，重复提取一次，合并两次提取液，提取液于40 ℃水浴中旋转至干。加10.0 mL甲醇溶解残留物，再加入2 mL正己烷涡旋混合30 s，转入离心管中，以4 000 r/min离心5 min，弃上层液，取下清液，过0.22 µm滤膜，待液相色谱-串联质谱测定。

1.3.2 不确定度来源分析

通过对测量过程的分析，并结合计算公式，可以归纳出以下几个不确定度来源[5]。①测量重复性引起的不确定度（A类）。②样品前处理引起的不确定度（B类）（天平引起的不确定度与1.0 mL移液管引起的不确定度）。③标准曲线溶液配制带入的不确定度（B类）。④工作曲线拟合引起的不确定度（B类）。⑤仪器引起的不确定度（B类）。

1.3.3 数学模型建立

数学模型建立如下：

式中：X样为试样中恩诺沙星的含量，µg/kg；m样为鱼肉的质量，g；C样为样液中恩诺沙星的浓度，ng/mL；CBlank为空白中恩诺沙星的浓度，ng/mL；V为样液最终的定容体积，mL。

2 结果与分析

2.1 测量重复性引起的相对标准不确定度urel(d )（A类）

按农业部1077号公告—1—2008方法对同一样品平行测定6次，结果见表1。由重复性测定结果可得测量标准偏差S，并计算重复性相对标准不确定度urel(d)为：

表1 重复性测定结果

式中：xi为第i次测量的测定值，µg/kg；n为测量次数；x—为n次测量所得的算术平均值，µg/kg。

2.2 样品前处理引起的相对标准不确定度urel(r)（B类）

2.2.1 天平引起的相对标准不确定度urel(r1)

称取5 g试样，天平的准确度a为0.01 g，采用矩形分布计算天平的不确定度和相对标准不确定度为：

2.2.2 1.0 mL移液管引起的相对标准不确定度urel(r2)样品前处理过程加入1.0 mL流动相溶解残留物，1.0 mL移液管准确度a为±0.007 mL，见表2，采用矩形分布计算1.0 mL移液管的不确定度和相对标准不确定度为：

2.3 标准曲线溶液配制带入的相对标准不确定度urel(s)（B类）

2.3.1 标准溶液准确度引起的相对标准不确定度urel(s1)

本实验采用的恩诺沙星标准溶液由BePure公司提供，浓度为100.2 µg/mL，已知标准物质证书给出的恩诺沙星的不确定度a为±3%（k=2），恩诺沙星标准溶液的相对标准不确定度为：

2.3.2 稀释体积带入的相对标准不确定度urel(s2)

据《常用玻璃量器计量检定规程》（JJG 196—2006）[4]A级玻璃量器的允差（表2），按均匀分布。各移液管和容量瓶的标准不确定度见表2。

表2 实验室A级单标线玻璃量器的分度值与容量允差

其中，1 mL移液管移取1.0 mL 100.2 µg/mL标准溶液于100 mL容量瓶中，甲醇定容得到浓度为 1 µg/mL的标准溶液，将1 µg/mL的标准溶液进行逐级稀释，配制成浓度点为1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、40 ng/mL和50 ng/mL的标准系列，分别计算移液管和容量瓶的相对不确定值，见表3。

表3 不同标准浓度的不确定值

则稀释体积带入的相对标准不确定度为：

将以上标准曲线溶液配制过程中各相对标准不确定度，按照下列公式进行合成，则标准曲线溶液配制带入的相对不确定度为：

2.4 工作曲线拟合引起的相对标准不确定度urel(p)（B类）

配制6个浓度的标准溶液，用LC-MS/MS重复测定3次，得到各浓度的色谱峰面积，用最小二乘法对恩诺沙星浓度-峰面积进行拟合，得到标准工作曲线为y=ax+b（y为峰面积，x为浓度）和相关系数，结果见表4。

根据表4中标准工作曲线y=91 996.2x+18 727.1，进行数据分析，各浓度点峰面积计算结果见表5。

表4 线性关系测定结果

由表5可知，标准系列溶液浓度的平均值x—= 21.83 ng/mL，由标准曲线拟合引入的相对标准不确定度为：

表5 峰面积计算结果表

2.5 LC-MS/MS仪器引起的相对标准不确定度urel(X)（B类）

经检定，LC-MS/MS仪器的不确定度为0.02，k=2，由LC-MS/MS仪器引入的相对标准不确定度

3 合成标准不确定度的评定

各相对标准不确定度见表6。

表6 各相对标准不确定度结果表

由表6可知，鱼肉中恩诺沙星检测结果的合成标准不确定度ucrel为：

4 扩展不确定度的评定与结果

根据CNAS—GL06：2006[2]，取k=2，被测量值大约95%含于此区间，则相对扩展不确定度为U=ucrel×k=0.051 90×2=0.104。本次实验测得样品中恩诺沙星的最佳估值为X=60.8 µg/kg，则其扩展不确定度为U=60.8 µg/kg×0.104≈6.32 µg/kg。

5 结论

在LC-MS/MS测定鱼肉中恩诺沙星残留量时，应调整标准曲线的权重，降低工作曲线拟合引起的不确定度，提高检验人员的操作水平，定期对仪器进行校准，测试平行样，严控前处理各环节，减少引入的不确定度，提高检测结果的准确性。