化妆品中10种α-羟基酸的高效液相色谱检测及质谱确证

郑梅，贾昌平（苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州 215104）

抗皱、延缓皮肤衰老是大多数亚洲女性一直关注的美容问题之一。α-羟基酸，又称果酸，作为一种能促进皮肤再生的皮肤调理剂广泛用于护肤类化妆品中[1-3]。α-羟基酸是在羧基（-COOH）面第一个（α）碳原子位置上有一个羟基（-OH）的有机酸[4]。近年来α-羟基酸换肤已成为一种美容护肤的新趋势，但诱发的皮肤过敏问题也屡见不鲜[5]。美国FDA在2006年发表了一份关于α-羟基酸的研究报告显示，长期使用α-羟基酸可能会减弱皮肤对紫外线的抵抗力，使皮肤老化，加速细胞的破坏或死亡，导致皮肤发红、起泡及灼伤，可能给皮肤造成永久性的伤害，其长期的安全性无法得到保障[6-7]。因此须严格控制α-羟基酸的含量。

我国2015年版《化妆品安全技术规范》规定化妆品配方中α-羟基酸总量不得大于6%，但只检测了酒石酸、羟基乙酸、苹果酸、乳酸和柠檬酸5种成分[8]。2019年国家药品监督管理局发布的第12号通告中提供了10种α-羟基酸的液相检测方法，但实际应用中发现，部分样品在待测物出峰位置存在杂质干扰，这对检测方法的专属性提出了更高的要求。目前，关于化妆品中α-羟基酸的检测方法主要有高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法、气相色谱法、离子色谱法等[9-12]，但仅检测了酒石酸、羟基乙酸、苹果酸、乳酸和柠檬酸，远不能满足对化妆品中实际使用的多种α-羟基酸检测的需要。考虑到化妆品基质种类较多，成分复杂，本文采用高效液相色谱法同时测定化妆品中10种α-羟基酸的含量，并对阳性样品进行液相色谱-串联质谱法确证，避免假阳性结果的产生，以期为化妆品中10种α-羟基酸的质量监管提供技术参考。

1 材料

1.1 试药

1.2 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Agilent 6538高效液相质谱仪（美国Agilent公司）；KQ-300DA型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液 分别精密称取葡糖醛酸、酒石酸、羟基乙酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、2-羟基丁酸、扁桃酸、二苯乙醇酸、羟基辛酸对照品适量，置于同一50 mL的量瓶中，用水溶解并稀释成质量浓度分别为4.0、2.0、4.0、4.0、5.0、4.0、5.0、0.1、0.1、4.0 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液 称取样品约1 g（精确到0.0001 g）置于10 mL具塞比色管中，置于90℃水浴中30 min以去除挥发性有机溶剂，加水至10 mL，涡旋混合30 s，60℃超声提取30 min，取适量样品在10 000 r·min-1下高速离心15 min，上清液用0.45 μm滤膜过滤，作为供试品溶液[8]。

2.1.3 阴性样品溶液 取空白膏霜剂作为阴性样品基质，按“2.1.2”项下方法制备阴性样品溶液，即得。

2.2 色谱与质谱条件

2.2.1 高效液相色谱条件 色谱柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18AQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A为0.1 mol·L-1的磷酸氢二铵溶液（磷酸调pH 2.45），流动相B为甲醇；柱温30℃；检测波长214 nm；进样量5 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序 Tab 1 Gradient elution program

2.2.2 高效液相色谱-串联质谱确证条件 色谱柱：CORTECS UPLC T3（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流动相以0.1%甲酸水溶液为流动相A，乙腈（0.1%甲酸）溶液为流动相B，梯度洗脱（0～5 min，100%A；5～8 min，100%→5%A；8～9 min，5%A；9～9.1 min，5%→100%A；9.1～10 min，100%A）；柱温30℃；流速0.3 mL·min-1；进样量5 μL。电离方式：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：负离子检测；检测方式：一、二级全扫描；毛细管电压：3.0 kV；脱溶剂温度：350℃；脱溶剂气流速：600 L·h-1。10种α-羟基酸的质谱参数见表2，二级质谱图见图1。

表2 10种α-羟基酸的质谱分析参数 Tab 2 MS/MS parameters for the detection of 10 α-hydroxy acids

图1 10种α-羟基酸的二级质谱图Fig 1 MS2 spectrum of 10 α-hydroxy acids

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 分别取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液及空白溶剂（水），按“2.2.1”项下方法进样5 μL，结果见图2。空白溶剂和阴性样品溶液不干扰待测物的测定，各峰保留时间适中，分离度良好。

图2 空白溶剂（A）、阴性样品溶液（B）、对照品溶液（C）及供试品溶液（D）典型色谱图Fig 2 Chromatogram of blank solution（A），negative sample solution（B），reference solution（C）and sample solution（D）

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液0.25、0.5、1、2、5、10 mL于20 mL量瓶中，加水溶解，稀释至刻度，摇匀，得到系列对照品溶液，分别按“2.2.1”项下方法分别测定，记录色谱图。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果见表3。

2.3.3 定量限与检测限 取“2.1.1”项下混合对照品溶液，用水逐级稀释，按“2.2.1”项下方法测定，以信噪比（S/N）为3和10分别计算仪器的检测限（LOD）和定量限（LOQ），结果见表3。

③企业所得税研发费用加计扣除规定：“企业发生的研究开发费用，未形成无形资产计入当期损益的，在按照规定据实扣除的基础上，按照研究开发费用的50%加计扣除，形成无形资产的，按照无形资产成本的150%摊销。”

表3 线性关系、检测限和定量限 Tab 3 Linearity，limit of detection and limit of quantization

2.3.4 精密度试验 取“2.1.1”项下混合对照品溶液，按“2.2.1”项下方法重复进样6次，结果10种α-羟基酸峰面积的RSD在0.25%～2.3%，表明仪器精密度良好。

2.3.5 加样回收试验 以空白水剂、膏霜剂、乳剂作为基质考察本方法的回收率。精密称取空白基质1 g于10 mL具塞比色管中，分别加入0.5、2.0、5.0 mL混合对照品溶液，作为低、中、高浓度的加标溶液，按“2.1.2”项下方法制备，每个浓度平行配制3份，进样测定，计算平均加样回收率。结果葡糖醛酸、酒石酸、羟基乙酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、2-羟基丁酸、扁桃酸、二苯乙醇酸、羟基辛酸的加样回收率分别在98.3%～106.5%（RSD在0.40%～4.4%）、100.2%～108.5%（RSD在0.40%～2.2%）、99.6%～108.9%（RSD在0.30%～2.4%）、99.4%～104.6%（RSD在0.30%～3.1%）、102.7%～109.6%（RSD在0.60%～3.0%）、94.7%～105.6%（RSD在1.0%～4.1%）、101.0%～105.3%（RSD在0.60%～4.1%）、94.2%～111.9%（RSD在0.60%～4.8%）、97.5%～106.5%（RSD在0.80%～3.8%）、96.1%～105.6%（RSD在1.1%～4.7%）。

2.3.6 重复性试验 取某批号阳性样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.2.1”项下条件测定，结果样品中乳酸平均含量为0.4%，RSD为1.4%，表明该方法重复性良好。

2.3.7 稳定性试验 取“2.1.1”项下混合对照品溶液，于室温下放置0、1、2、4、8、12、24 h后进样分析，结果葡糖醛酸、酒石酸、羟基乙酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、2-羟基丁酸、扁桃酸、二苯乙醇酸、羟基辛酸峰面积的RSD分别为0.33%、0.25%、2.6%、0.32%、0.47%、0.42%、0.91%、0.65%、1.8%、1.6%，可满足分析测试要求。

2.3.8 样品测定 采用本文建立的方法对30批化妆品进行检测。经高效液相色谱法初筛，3批样品中疑似含有α-羟基酸，需进行液质确证。当样品的提取离子流图中出现与标准品溶液保留时间一致的色谱峰，且色谱峰的一级、二级质谱的特征离子（m/z）信息均一致时，则可判定样品中检出相应的α-羟基酸化合物。结果显示1份样品检出羟基乙酸，含量为0.6%；2份样品检出乳酸，含量分别为0.4%、1.3%；其余样品未检出α-羟基酸。阳性样品液质确证谱图见图3和图4。

图3 阳性样品中羟基乙酸的提取离子流图（A）和二级质谱图（B）Fig 3 Extracted ion chromatogram（A）and MS2 spectrum（B）of glycolic acid in the positive samples

图4 阳性样品中乳酸的提取离子流图（A）和二级质谱图（B）Fig 4 Extracted ion chromatogram（A）and MS2 spectrum（B）of lactic acid in the positive samples

3 讨论

3.1 色谱柱的选择

本试验检测的10种化合物极性均较大，需要选择耐水相色谱柱。本研究考察了Agilent ZORBAX SB-AQ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters Atlantics T3（4.6 mm×250 mm，5 μm）、SHISEIDO CAPCELL PAK C18AQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）三种品牌的色谱柱，以目标化合物分离度和峰形为选择依据，结果显示，当使用Agilent ZORBAX SB-AQ C18柱时，苹果酸、乳酸和柠檬酸稍有拖尾；当使用Waters Atlantics T3柱时，10种化合物的响应均偏低；而当使用SHISEIDO CAPCELL PAK C18AQ柱时，各化合物分离效果较好，峰形对称，出峰时间适中。SHISEIDO CAPCELL PAK C18AQ柱填料为新型聚合物包被的硅胶，在100%的水系流动相中具有良好稳定性，能有效分离高极性化合物，因此是最适用的色谱柱。

3.2 流动相pH的选择

参考文献[6，10]，考察磷酸氢二铵溶液不同pH值（2.3、2.45、3.0）对目标化合物色谱行为的影响。结果显示，当pH值为3.0时，酒石酸与羟基乙酸不能完全分离，色谱峰有重叠现象；当pH值为2.3时，二苯乙醇酸和羟基辛酸色谱峰前延，峰形较差；而pH值为2.45时，各成分色谱峰的分离度良好，均能达到基线分离。

3.3 提取方法的选择

以10种α-羟基酸峰面积大小为考察依据，考察了不同提取时间（15、30、45 min）、超声温度（室温、40℃、60℃、80℃）、溶剂用量（10、20、25 mL）对提取效率的影响，结果表明不同溶剂用量对检测结果无明显影响，从操作简便性和成本考虑，最终选择10 mL为溶剂用量。当提取时间30 min、超声温度60℃时，10种α-羟基酸峰面积达到最大值，因此选择30 min为最佳提取时间、60℃为最佳超声温度。

3.4 小结

本研究建立了化妆品中10种α-羟基酸的高效液相色谱检测及液相色谱-串联质谱确证方法，该方法快速、简便、准确度高、专属性强，可为化妆品中α-羟基酸类化合物的测定提供参考，对严格规范我国化妆品市场具有重要意义。