基于指纹图谱和多指标成分含量测定的枳壳与枳实药材质量差异性研究

童培珍，李国卫，何嘉莹，邱韵静，王利伟，徐敏，何广铭（广东一方制药有限公司 广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244）

枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实，7月果皮尚绿时采收，具有理气宽中，行滞消胀之功效，临床常用于胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、脏器下垂[1]；枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensisOsbeck的干燥幼果，5～6月收集自落的果实，具有破气消积、化痰散痞的作用，临床常用于积滞内停、痞满胀痛、泻痢后重、大便不通、痰滞气阻、胸痹、结胸、脏器下垂[1]。《本草纲目》曰：“枳实、枳壳，气味功用俱同，上世亦无分别，魏晋以来，始分实、壳之用。洁古张氏，东垣李氏，又分治高治下之说。大抵其功皆能利气，气下则痰喘止，气行则痞胀消，气通则痛刺止，气利则后重除。故以枳壳利胸膈，枳实则利肠胃，然张仲景治胸痹痞满，以枳实为要药，诸方治下血诸痢，大肠秘塞，里急后重，又以枳壳为通用，则枳实不独治下，而枳壳不独治高也[2]。”枳实苦重性寒，善于破气消积，枳壳味苦酸性微寒，善于理气宽中，两者性能各有侧重，不可代用。研究表明，枳壳与枳实中含量较高的为黄酮类成分和香豆素类成分，具有调节胃肠道、抗癌等多种生物活性[3-7]。目前已有文献报道不同物候期枳实、枳壳黄酮类和生物碱类成分变化，或是对枳壳与枳实黄酮类成分进行单一定性定量研究，无法系统地评价枳壳与枳实的差异[8-14]。枳壳和枳实来源几乎相同，化学成分也相似，通过外观颜色和果实大小只能进行主观评价，可能会对其鉴别造成误差，难以保证临床药效。现有文献报道枳实及枳壳的含量或指纹图谱多采用高效液相色谱法进行测定，耗时长。本研究采用UPLC法建立枳实与枳壳的指纹图谱，利用主成分分析及偏最小二乘法-判别分析寻找枳实及枳壳的主要差异成分；对上述差异性成分进行定量分析，大大缩短了检测时间，为枳壳和枳实的整体质量评价提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Waters Acquity UPLC H-Class型超高效液相色谱仪（四元泵，PDA检测器）；Mettler-Toledo ME204E型万分之一电子分析天平、Mettler-Toledo XP26型百万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；HWS28型恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；Milli-Q Direct超纯水系统（默克股份有限公司）。

1.2 试药

柚皮苷（批号：110722-201714，含量：93.4%）、橙皮苷（批号：110721-201818，含量：96.20%）、新橙皮苷（批号：111857-201804，含量：99.4%）（对照品，中国食品药品检定研究院）；芸香柚皮苷（批号：wkq19041908，含量：98.0%）、水合橙皮内酯（批号：wkq20031904，含量：98.0%）、川陈皮素（批号：wkq20031701，含量：98.0%）、橘红素（批号：wkq16011401，含量：98.6%）（对照品，四川维克奇生物科技有限公司）；马尔敏（批号：CFS201901，含量：98.0%，Chem Face生物有限公司）。乙腈（默克股份有限公司），磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司），甲醇（西陇科学股份有限公司），水为自制超纯水。

枳壳与枳实经广东一方制药有限公司质量中心鉴定：枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实（编号：ZQ1-ZQ18）；枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种的干燥幼果（编号：ZS1-ZS10），样品详细信息见表1。

表1 样品信息表 Tab 1 Information source of sample

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent SB C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；以乙腈为流动相A，0.05%磷酸水为流动相B，梯度洗脱（0～7 min，15%→25%A；7～8 min，25%→40%A；8～10 min，40%→45%A；10～13 min，45%→60%A；13～15 min，60%→15%A）；流速为0.4 mL·min-1；柱温为30℃；检测波长为320 nm；进样量为2 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素、橘红素对照品适量，加甲醇制成含芸香柚皮苷336.6 μg·mL-1、柚皮苷257.4 μg·mL-1、橙皮苷221.6 μg·mL-1、新橙皮苷105.7 μg·mL-1、水合橙皮内酯69.1 μg·mL-1、马 尔 敏225.3 μg·mL-1、川陈皮素219.7 μg·mL-1、橘红素256.4 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取枳壳和枳实粉末（过三号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流提取1.5 h，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。

2.4 指纹图谱研究

2.4.1 精密度试验 取枳壳样品（ZQ17）粉末约0.2 g，精密称定，制备供试品溶液，连续进样6次，以新橙皮苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果显示18个共有峰相对保留时间RSD在0.010%～0.040%，相对峰面积RSD在0.040%～0.89%，均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取枳壳样品（ZQ18）粉末约0.2 g，精密称定，制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12 h进样测定，以新橙皮苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果显示18个共有峰相对保留时间RSD在0.040%～0.15%，相对峰面积RSD在0.120%～0.63%，均小于2.0%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 取枳壳样品（ZQ17）粉末约0.2 g，平行6份，精密称定，制备供试品溶液，进样测定，以新橙皮苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果显示18个共有峰相对保留时间相对保留时间RSD在0.020%～0.040%，相对峰面积RSD在0.34%～2.2%，均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.5 指纹图谱测定结果与分析

2.5.1 枳壳与枳实共有峰的确定 取18批枳壳样品和10批枳实样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，结果得到18个共有峰，通过对照品指认了8个峰，分别为芸香柚皮苷（峰1）、柚皮苷（峰2）、橙皮苷（峰4）、新橙皮苷（峰5）、水合橙皮内酯（峰7）、马尔敏（峰13）、川陈皮素（峰15）、橘红素（峰18）。其中新橙皮苷分离度好，保留时间适中，峰形稳定，设为参照峰（S）。见图1～3。

图1 18批枳壳指纹图谱叠加图Fig 1 Fingerprint and chromatogram of 18 batches of Aurantii Fructus

图2 10批枳实指纹图谱叠加图Fig 2 Fingerprint and chromatogram of 10 batches of Aurantii Fructus Immatutus

2.5.2 相似度评价 分别将18批枳壳和10批枳实指纹图谱导入“中药指纹图谱相似度评价系统（2012.0版本）”，生成枳壳和枳实对照指纹图谱。结果显示，18批枳壳与枳壳对照指纹图谱的相似度在0.943～0.998；10批枳实与枳实对照指纹图谱相似度在0.965～0.998。相似度均大于0.940，说明不同批次同种药材质量大体一致。18批枳壳与枳实对照指纹图谱的相似度在0.843～0.989；10批枳实与枳壳对照指纹图谱相似度在0.845～0.996，相似度均大于0.84，说明同一基原不同采收期的两种药材相似度较高，仅通过相似度评价难以区分（见表2）。

表2 相似度评价结果 Tab 2 Similarity evaluation

图3 对照品、供试品UPLC色谱图Fig 3 UPLC of reference substance and sample

2.5.3 聚类分析 将枳壳与枳实色谱峰峰面积导入SPSS 20.0软件进行聚类分析，采用组间联接法，选用欧氏距离进行聚类分析，结果见图4。由聚类分析结果可知，枳壳与枳实明显地分成两大类，一类为枳壳样品（Ⅰ），另一类为枳实样品（Ⅱ），说明枳壳和枳实样品间存在一定的差异。

图4 枳壳与枳实样品聚类分析结果Fig 4 Clusster analysis of Aurantii Fructus and Aurantii Fructus Immatutus

2.5.4 主成分分析 将枳壳与枳实的共有峰峰面积导入SIMCA 14.1软件进行主成分分析。结果前三个主成分的累积贡献率为73.1%，说明前三个主成分基本能反映枳壳与枳实样品的主要特征（见图5）。以前三个主成分建立坐标系，构建枳壳与枳实的主成分分析得分图（见图6）。由得分图可知，枳壳与枳实聚为两类。结合聚类分析和主成分分析结果，表明枳壳与枳实的化学成分含量存在明显差异。

图5 主成分方差贡献率Fig 5 Variance contribution rate of principal components

图6 主成分分析得分图Fig 6 Principal components scores

2.5.5 偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA） 为了进一步比较枳壳与枳实化学成分的差异和寻找两者之间的差异性化合物，笔者进行了PLS-DA建模分析。PLS-DA模型中，R2Y为0.923，Q2Y为0.871，均大于0.5，说明建立的模型稳定可靠。由PLS-DA得分图可知（见图7），枳壳与枳实明显分为两类，与聚类分析和主成分分析结果一致。通过变量重要性投影值（VIP）筛选出两者间化学成分差异的主要标志性成分（见图8）。以VIP值大于1作为标准筛选，贡献由大到小的7个变量依次为：峰5、峰6、峰2、峰9、峰10、峰4、峰12。通过对照品指认出3个成分，分别为峰5新橙皮苷、峰2柚皮苷，峰4橙皮苷，其中峰5新橙皮苷的VIP值最大，是枳壳与枳实差异最大的峰。

图7 PLS-DA得分图Fig 7 PLS-DA scores

图8 枳壳与枳实差异标志物的VIP图Fig 8 VIP value of Aurantii Fructus and Aurantii Fructus Immatutus

2.6 含量测定

由指纹图谱测定结果可知，枳壳与枳实化学成分类似，但存在含量间的差异。故采用UPLC法对枳壳和枳实的4个黄酮类成分（芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷）和4个香豆素类成分（水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素、橘红素）进行含量测定。

2.6.1 精密度考察 取“2.2”项下混合对照品，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，结果芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素、橘红素8个成分峰面积RSD分别为0.52%、0.83%、1.0%、1.3%、1.1%、1.2%、1.6%、1.0%，表明仪器精密度良好。

2.6.2 稳定性考察 取枳壳样品（ZQ17）粉末约0.2 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、12 h进样测定，计算芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素、橘红素8个成分峰面积RSD分别为1.6%、1.6%、1.4%、1.3%、1.6%、1.6%、1.1%、1.7%，表 明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.6.3 线性关系考察 精密移取“2.2”项下对照品溶液，加甲醇稀释成6个不同质量浓度的对照品溶液，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果见表3。

表3 回归方程及线性范围 Tab 3 Regression equation and linearity

2.6.4 重复性试验 取枳壳样品（ZQ17）粉末约0.2 g，平行6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素、橘红素8个成分含量RSD分别为1.6%、0.82%、0.66%、1.1%、1.3%、1.6%、1.1%、1.7%，表明该方法重复性良好。

2.6.5 加样回收试验 取已知含量的枳壳样品（ZQ17）粉末约0.1 g，精密称定，平行6份，1∶1加入对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算各成分的加样回收率。结果8种成分的平均回收率在96.14%～104.88%，RSD在0.91%～4.2%。

2.6.6 样品测定结果 精密吸取18批枳壳和10批枳实供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果见表4。除川陈皮素外，枳实整体含量高于枳壳，尤其是柚皮苷和新橙皮苷含量远高于枳壳含量，说明柚皮苷和新橙皮苷为枳壳与枳实的差异性化合物，与PLS-DA分析结果一致。

表4 含量测定结果(mg·g-1) Tab 4 Content determination (mg·g-1)

2.6.7 结果分析 以上述8个含量测定指标为检验变量，枳壳与枳实作为分组变量，采用SPSS 20.0软件进行独立样本检验分析，由表5可知，芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素含量在枳壳与枳实中差异具有统计学意义（P＜0.05）；橘红素含量无显著性差异（P＜0.05）。综上，说明除橘红素外，枳壳与枳实其余7个指标成分含量变化明显。

表5 独立样本检验分析表 Tab 5 Independent sample analysis

3 讨论

本试验在流动相、检测波长、柱温、流速等色谱条件优化基础上，采用UPLC法对18批枳壳药材和10批枳实药材进行研究，建立了指纹图谱，标定了18个共有峰，通过对照品指认出8个色谱峰。相似度分析结果表明，枳壳药材与枳实药材样品相似度均大于0.90，枳壳药材与枳实药材指纹图谱共有峰一致，表明两者所含化学成分基本一致，但两者共有峰峰面积相差较大，表明枳壳药材与枳实药材某些化学成分含量差异较大。为寻找枳壳药材与枳实药材差异性化合物，采用了聚类分析、主成分分析及PLS-DA分析等方法进行分析，均能对枳壳与枳实进行识别与聚类，并确认了新橙皮苷、柚皮苷和橙皮苷等7个成分是枳壳与枳实质量差异的主要物质。

本研究在指纹图谱基础上，对枳壳药材和枳实药材中8个指标性成分进行含量测定，除川陈皮素外，枳实整体含量高于枳壳，尤其是柚皮苷和新橙皮苷含量远高于枳壳药材，与文献[8，14-15]报道一致。黄酮类成分随着果实成熟而呈下降趋势，这与其在植物体内的代谢转化过程相关，多种因素对不同生长发育阶段物质成分的积累具有一定影响。现代药理研究表明，黄酮类化合物如橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷可促进胃肠动力，有明显的促进胃排空、胃肠蠕动作用，这与枳实行气力量较大，多用于破积导滞，通利大便，而枳壳作用较缓，长于理气宽胸，消胀除痞的作用相一致，两者功效性能不一，临床应用也有所侧重。本试验通过建立指纹图谱和多指标成分含量测定的方法，可较好地反映枳壳与枳实指纹图谱的差异，也可为枳壳与枳实药材的鉴别和质量评价提供依据。