抗人球蛋白试验在RhD、ABO血型抗原鉴定的应用效果

刘敏静,杜思远,高艳珠,李健茹,赵子贤（广东省江门市新会区人民医院,广东 江门 529100）

新生儿溶血病（Hemolytic disease of the newborn，HDN）是由母婴血型不合、红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Erythrocyte glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-PD）缺乏、球形红细胞增多症等原因所引起的新生儿疾病，其中多数原因为母婴血型不合[1]。后者是母体与新生儿红细胞抗原不配合，激活母体免疫系统被动产生免疫性的免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）G抗体进入胎儿体内，可使得新生儿的网状内皮系统受到破坏，从而形成被动免疫性溶血性疾病[2-3]。ABO血型不合是引起新生儿溶血病最常见的原因，大约3.5%的新生儿溶血病是因ABO血型不合所导致的[4]。Rh新生儿溶血病是由于母婴Rh血型不合所致的IgM免疫抗体作用于胎儿红细胞造成的高胆红素血症，可由人类红细胞刺激引起同族免疫作用而产生[5]。抗人球蛋白试验（Antiglobulin test，AGT）是检查不完全抗体的一种经典方法，是利用抗人球蛋白血清与体内致敏红细胞产生凝集的原理，检查红细胞是否致敏的试验[6]。但传统的抗人球蛋白试验是一种以抗球蛋白法为基础的凝聚胺法，在低离子介质中可促进红细胞和血清之间的抗原抗体反应。改良的抗人球蛋白法是在经典法的基础上，利用二硫苏糖醇作为裂解液，将凝聚胺试剂作为加速剂，能提高检测效果[7]。本文具体探讨并对比了抗人球蛋白试验在RhD、ABO血型抗原鉴定中的应用效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究材料 选择2018年9月-2021年11月在本院建档分娩的夫妇ABO血型不合或RhD血型不合的孕妇78例作为研究对象。

纳入标准：单胎活妊娠；孕周≥28周；孕妇知情同意本研究；年龄20-45岁；医院医学伦理委员会批准了此次研究（批准号为87725552）。排除标准：临床资料缺乏者；合并肿瘤者；合并先天性免疫性疾病者。

抗A标准血清、抗B标准血清购自上海生工公司，ABO标准红细胞试剂盒购自大连TAKARA公司。抗D抗体购自Bio-rad公司，抗球蛋白试剂购自上海血液生物医药有限责任公司，低离子抗人球蛋白卡、凝聚胺介质试剂购自珠海贝索生物技术有限责任公司。

在78例孕妇中，年龄最小22岁，最大43岁，平均年龄（29.48±1.58）岁；平均体重指数（2 6.2 9±1.2 2）k g/m2；平均孕周（3 4.0 2±2.2 8）周；平均产次（1.87±0.24）次；平均孕次（2.58±0.28）次。

1.2 配偶血型鉴定 采用玻片正定型法、试管反定型法进行配偶血型鉴定，在玻片正定型法中，将抗A定型试剂、抗B定型试剂各一滴分别滴于玻片上A、B处，分别取等体积10.0%红细胞悬液或全血于抗A定型试剂和抗B定型试剂处，混匀后观察凝集状况进行结果判定。在试管反定型法中，取孕妇血清1滴分别加入3支标记好的小试管中，加入RhD试剂红细胞，1000rpm/min离心1min，混匀后观察凝集状况进行结果判定。

1.3 抗人球蛋白试验方法 所有孕妇都给予经典抗人球蛋白法（经典法）、改良抗人球蛋白法（改良法）测定孕妇血清中IgG抗A(B)效价、抗D抗体，检查前取试验患者红细胞悬液50μl；取微柱凝胶抗人球蛋白检测卡，加入红细胞悬液，置入卡式离心机离心5min，观察凝集反应，对显示阳性的标本进一步实施分型操作。比如在改良法中，用蒸馏水按1∶20的比例稀释浓缩洗涤液，加入孕妇血清和裂解液各0.2ml，混匀后在37℃环境中孵育30min。选择小试管16支，各加洗涤液0.1ml，倍比稀释血清与红细胞悬液形成洗涤液。向小试管中加入洗涤液，混合后离心1min，留取红细胞，然后加入抗IgG抗体0.05ml，观察红细胞凝集情况。

两种方法的结果判断方法如下：以肉眼可见红细胞凝集(+)的最高稀释倍数的倒数即为抗A(B)抗体、抗D抗体的抗体效价。

根据效价结果阳性和阴性结果的判定原则，所有效价≥1∶64的标本可判定为阳性结果。

1.4 统计方法 本次研究统计软件为SPSS22.00，P＜0.05表示差异有统计学意义。计量数据与计数数据分别以均数±标准差、n%等表示，对比为t检验与卡方χ2检验等。

2 结果

2.1 新生儿溶血病鉴定情况对比 在78例孕妇中，改良法判断为ABO新生儿溶血病44例，RhD新生儿溶血病6例；经典法判断为ABO新生儿溶血病41例，RhD新生儿溶血病5例，对比无差异（P＞0.05）。见表1。

表1 两种方法对新生儿溶血病鉴定情况对比[n(%)]

2.2 IgG抗A(B)效价对比 经典法的IgG抗A(B)效价阳性率为9.0%（7/78），改良法的IgG抗A(B)效价阳性率为25.6%（20/78），改良法的IgG抗A(B)效价阳性率高于经典法（χ2=7.569，P＜0.05）。见表2与表3。

表2 经典法测定IgG抗A(B)的效价(n=78)

表3 改良法测定IgG抗A(B)的效价(n=78)

2.3 Ig抗D效价对比 经典法的Ig抗D效价阳性率为2.6%（2/78），改良法的Ig抗D效价阳性率为11.5%（9/78），改良法的Ig抗D效价阳性率高于经典法（χ2=4.792，P＜0.05）。见表4与表5。

表4 经典法测定Ig抗D的效价(n=78)

表5 改良法测定Ig抗D的效价(n=78)

3 讨论

新生儿溶血病在临床上比较常见，可导致胎儿红细胞被破坏，新生儿出现水肿、黄疸、贫血，甚至出现死胎。新生儿溶血病的主要病因是母婴血型不合，包括ABO血型不合与RhD血型不合[8]。ABO血型鉴定与RhD血型鉴定是临床重要检验项目，是判断母婴血型相容性的重要依据。由于各种因素的影响，当前对于血型鉴定多采用血清检验方法，虽然有一定的效果，但是低效价血清抗体检测操作比较复杂，也容易出现各种假阳性。抗人球蛋白试验是将抗人球蛋白血清加入已经致敏的红细胞盐水悬液中，红细胞表面的抗球蛋白与抗人球蛋白血清中的抗体发生特异性反应，使红细胞发生凝集[9]。本研究显示在78例孕妇中，改良法判断为ABO新生儿溶血病44例，RhD新生儿溶血病6例；经典法判断为ABO新生儿溶血病41例，RhD新生儿溶血病5例，对比无差异（P＞0.05），表明经典法与改良法对于新生儿溶血病的诊断具有良好的一致性，具有很好的应用价值。

ABO血型不合导致的新生儿溶血病是由于母婴ABO血型不合，可使得胎儿的单核巨噬细胞系统内受到免疫性破坏，从而诱发溶血[10-11]。IgG抗A(B)抗体效价与溶血程度有一定的相关性，但是也与新生儿A(B)抗原强弱、胎盘屏障作用、血型物质含量等有关。Rh血型抗体只能由人类红细胞作为抗原刺激引起同族免疫作用而产生，血清中含有Rh抗体的孕妇，如果受孕一个Rh阳性胎儿，Rh抗体可通过胎盘进入胎儿体内，破坏胎儿红细胞引起新生儿溶血病[12]。而出现胎盘出血与产道损伤，红细胞便可进入母体内，刺激母体产生Rh抗体，当母体再次妊娠可再次诱发新生儿溶血病的发生[13-14]。本研究显示，经典法的IgG抗A(B)效价阳性率为9.0%（7/78），改良法的IgG抗A(B)效价阳性率为25.6%（20/78），改良法的IgG抗A(B)效价阳性率高于经典法（χ2=7.569，P＜0.05）。经典法的Ig抗D效价阳性率为2.6%（2/78），改良法的Ig抗D效价阳性率为11.5%（9/78），改良法的Ig抗D效价阳性率高于经典法（χ2=4.792，P＜0.05），表明改良法的应用能提高对于新生儿溶血病与各血型效价的检测阳性率。从机制上分析，经典法是利用抗人球蛋白血清可与体内已经被不完全抗体或补体致敏的红细胞产生凝集反应的原理，可有效确定母婴血型不合导致的新生儿溶血病。抗人球蛋白试验为一项经典的免疫学实验，但是经典法忽略了自身抗体的存在，可能存在检测误差[15-17]。但大量阳性患者由于存在自身抗体，导致配血发生困难，可出现与所有供者样本凝集的现象，且难以鉴定出同种抗体[18]。而凝聚胺是多价阳离子聚合物，可促进红细胞和血清之间的抗原抗体反应，加速抗体致敏红细胞，可破坏红细胞间相互排斥的电位，可以提高试验的阳性率[19-21]。但是阴性结果仍需做抗球蛋白试验以防漏诊，还需以盐水试验作对照。在改良法中，将凝聚胺试剂作为加速剂可使红细胞致敏能力增强，缩短裂解时间，增强裂解效果[22]。本研究由于经费限制，纳入孕妇数量比较少，对比方法也比较少，将在后续研究中进一步探讨。

总之，不同抗人球蛋白试验在RhD、ABO血型抗原鉴定的应用都有很好的效果，改良法的应用能提高对于新生儿溶血病与各血型效价的检测阳性率。