血管化器官芯片在模拟生理和病理过程中的应用

刘宏婷，吉晓轩，李 菁，孙敏捷

（中国药科大学药学院药剂系，南京 210009）

康纳尔大学Shuler等［1-2］在21世纪前期首次提出在芯片上模拟人体的设想，即在芯片上培养人体不同器官的细胞，以此来构建人体组织。在过去10年里，器官芯片迅速发展，在生命科学研究中提供了体内模型的替代方法。特别是在血管研究领域，一直缺乏合适的体外模型模拟人体血管的三维结构和生理功能。而血管几乎存在于人体的每一个器官中，是人体循环系统的主要组成部分，是细胞生长和分化、器官发育和成熟、人体生理和病理过程所必需的。众所周知，血管系统在各种生理和病理过程中，通过血液与其他组织之间进行营养物、代谢物和其他分子的交换［3］。特别是病理过程，血管结构和功能的异常会导致或伴随着各种疾病的发生和进展，例如，黄斑变性［4］、动脉粥样硬化［5］、骨质疏松［6］、哮喘［7］和肿瘤［8］。为了对血管化组织和器官的生理和病理过程有更深入的探究，需要构建性能优异的体外模型用于研究血管系统，血管化器官芯片很好地满足了这一需求。

本文将讨论不同血管化器官芯片在基础研究和应用研究中的价值，描述血管化器官芯片在模拟生理和病理过程中的应用，对血管化器官芯片作为一种新型体外模型的优势与待解决的问题进行了概述。

1 血管化器官芯片的结构与功能

器官芯片是一种微流控设备，依托于微流体技术，在特定材料（如PDMS）组成的模具上培养多种细胞，以模拟组织和器官的生理和病理过程［9］。通过构建组织和器官水平的最小功能单元，来概括多细胞结构、组织-组织界面、理化性质、机械线索、血管结构等［10］。器官芯片作为一种新型的体外模型，与传统的体外模型相比，有更好的应用前景。

常规的2D 细胞培养已经有50多年的历史［11］，该方法被用于在体外评估药物对于不同细胞的作用，至今依然在生命科学研究领域被广泛使用。该方法被证明具有一定的价值，因其操作简单、可重复性强等特点，为科研人员提供了便利［12］。但是简单的静态环境无法真实地反映出体内复杂的相互作用信息，并且细胞的分化和功能受到限制［13］。3D细胞球体已经被广泛用于在体外研究药物的渗透性，空间和化学复杂性比2D 细胞培养高，但是球体过大可能会导致核心坏死［14］。类器官培养技术，是指在ECM 水凝胶中培养从患者身上分离的正常或癌性上皮干细胞，在体外形成自组织类器官型结构［15］。但是类器官在培养过程中产生的变化较大，导致在时间和空间上不稳定，难以进行采样、量化和分析［16］。以上3 种体外模型，都存在同样的缺点，即缺乏血管系统和机械线索。而临床前药物评价常用的动物模型，因为存在非同源性经常在临床上表现出较差的预测性，并且会带来严重的经济和伦理问题［17］。动物模型虽然存在血管系统和机械线索，但是缺乏时间和空间上的可观察性，无法确定相互作用的影响，难以帮助理解生理和病理过程。

血管化的器官芯片，即整合了血管结构和机械线索的器官芯片，近些年在药物临床前研究方面有比较优越的表现。特别是对于纳米药物分布和疗效的体外评价方面，提供了有前景的评估手段。

2 血管化器官芯片的应用

血管新生有两种方式，即血管再生（angiogenesis）和血管发生（vasculogenesis）［18］。血管再生是指现有血管中内皮细胞（ECs）通过增殖和迁移形成血管，通常也被称为血管尖端的血管再生芽［19］。血管发生被定义为血管的重新形成，是指原先单一存在的内皮细胞（ECs）或内皮祖细胞（EPCs）经过汇集、融合形成具有相应结构和功能的微血管［20］。在人体发展的不同阶段都存在血管新生，例如，胚胎发育［21］、缺血性疾病［22］、器官发生［23］、伤口愈合［24］以及肿瘤进展［25-26］等。在肿瘤研究中，血管再生和血管发生在实体瘤增殖和迁移过程中发挥着重要作用，可提供肿瘤生长和发育所需的营养物质、气体环境和分子交换等［10］。血管新生在器官芯片上的研究可分为两个部分，即模拟生理过程和模拟病理过程。在模拟病理过程部分，本文将着重回顾血管化肿瘤芯片的发展和应用。

2.1 血管化器官芯片模拟生理过程

自器官芯片领域的先驱Donald E. Ingber提出“器官芯片”这一新型的研究方向以来，已经有多种在体外模拟对应人体器官的器官芯片［9］。器官芯片作为人工器官的一种类型，有了飞速发展，良好的应用前景也使得它在药物评价的领域中占据一席之地。例如“肺芯片”，主要是在弹性、多孔PDMS 膜两侧，共培养人类肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞，内皮细胞的加入使得成功构造了血管化器官芯片，该芯片模拟呼吸运动且整合血液流动的机械线索［27］。而Zhu 等［28］构建了一种仿生人体肺芯片，模拟微生理呼吸结构。近期，Huang等［29］在芯片上构建了肺器官中更微小的结构——肺泡，在更接近肺泡真实解剖结构的基础上，进行肺部的生理过程探究。同样的，器官特异性实质细胞和器官特异性内皮细胞的共培养，也被应用于构建肠芯片、骨髓芯片、肝脏芯片、肾脏芯片、心脏芯片、皮肤芯片、大脑芯片（主要是血脑屏障芯片）［30-31］、子宫芯片［32］等。通过流体耦合肠道芯片、肝脏芯片、肾脏芯片，可以在体外定量预测口服给药后的人体药代动力学和药效学数据。通过流体耦合骨髓芯片、肝脏芯片、肾脏芯片，可以在体外定量预测静脉注射给药后的人体药代动力学和药效学数据［33］。以上研究构建了实质细胞-内皮细胞界面，在此界面的基础上整合多器官偶联和自动化流体设备，重点在于构建芯片上的人体，但没有构建更细节、更完整的血管系统，例如，内皮细胞成管、血管再生、血管发生等。

为了模拟血管形成过程，Kim等［34］构建了一种通用的器官芯片平台，可进行两种不同的血管形成过程，即血管再生和血管发生。共培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人正常肺成纤维细胞（LFs），LF 可分泌一些基质蛋白和可溶性因子，来诱导HUVEC 的迁移和支持HUVEC 的形态发生。可根据LF 的空间位置不同和HUVEC 的种植位置、方式不同，来模拟不同的血管新生过程。该芯片的设计在微流控体外模型方面具有广泛的应用，通过增加或减少通道数、打孔开顶等操作可以满足不同的实验需求。Lee 等［35］使用类似的微流控芯片，构建血管再生模型（图1），并且选择介孔二氧化硅纳米粒子（MSN）作为核酸递送的载体，形成包载小干扰RNA（siRNA）的纳米药物，分别对比siVEGF/MSN、siVEGFR/MSN 在微流控芯片中对3D 血管再生的体外调控，旨在评估两种纳米药物的抗血管再生潜力。该芯片还被用于构建血脑屏障的3D 脑血管再生模型［36］、评估靶向超声辅助药物递送［37］、构建微流控平台上的体内微环境仿生模型［38］、集成开顶结构的体外三维毛细血管床模型［39］、评价阳离子聚合物纳米粒子的3D 微血管模型［40］等。

Figure 1 Microfluidic chip for in vitro angiogenesis regulation[35]

另外，创建血管发生的微流体模型同样也引起了极大的兴趣，研究人员设计了一种含有多重腔室的微流体模型［41-42］，先将内皮细胞和水凝胶溶液均匀混合后同时注入到腔室内，使得内皮细胞均匀分散在水凝胶中（图2）。这些细胞可在水凝胶细胞支架中迁移、汇总，最终在菱形腔室内自发形成自组装微血管网络，该网络在灌注状态下可以保持功能的完整性。

Figure 2 Microfluidic chip for in vitro vasculogenesis regulation [42]A:Schematic of the microfluidic platform;B:Representative tissue chamber with vascular network on day 7 (ECFC-EC,red). Scale bar=100 μm PDMS:Polydimethyl siloxane

为了在体外实现平行多组实验、获得更多样本量的目的，van Duinen 等［43］构建了一种高通量体外平台，用于研究血管发芽（图3）。该平台集成在384孔板上，由40个独立的微流体单元组成。通过摇床的左右摇摆，实现了管腔的双向、可连续灌注，不需要复杂的管路和泵，以此降低了复杂性，拓宽了平台的应用范围。并且形成了稳定的生物分子梯度，有利于内皮细胞（EC）形成多种特征表型。最终在体外验证出血管内皮生长因子-165（VEGF-165）、佛波醇12-十四酸盐13-乙酸盐（PMA）、鞘氨醇-1-磷酸酯（S1P）的组合，是触发稳定的、定向血管再生的最佳混合物。虽然原代人类内皮细胞是体外血管模型中较为常用的一种细胞，但是因为提取繁琐、扩增困难、批次变化大等原因，使其在日常使用中受限。于是研究者使用同样结构的微流控芯片，以人类诱导多能干细胞（iPSC）为来源的内皮细胞替代原代人类内皮细胞，研究了iPSC-ECs 在生理相关条件下的血管再生［44］。van Duinen 等［45］还构建了另外一种高通量平台，集成在384 孔板上，有96 个独立的微流体单元，可以将内皮细胞培养成96 个三维可灌注的微血管。使用荧光标记的20 kD 右旋糖酐和150 kD右旋糖酐，可实时定量测定渗透性，基于此评估微血管的屏障功能。Poussin 等［46］利用该微流体平台96 芯片OrganoPlate®，使用人原代冠状动脉内皮细胞（HCAEC）构建了3D 微血管模型，建立了一种在灌注状态下检测单核细胞和内皮细胞黏附的测定方法。使用该模型评估了烟草加热系统（THS）2.2和3R4F 参比卷烟，验证了该模型可以在基于系统毒理学的风险评估中用于产品测试。

Figure 3 High-throughput microfluidic chip for angiogenic sprouting regulation [43]A: Bottom of the microfluidic chip based on a 384-well plate including 40 microfluidic devices; B: Every device consists of three channels. Phaseguides prevent the patterned gel from flowing into the adjacent channels

2.2 血管化器官芯片模拟病理过程——血管化肿瘤芯片

生理芯片主要是涉及到人体正常细胞的培养或组织界面生成等，而病理芯片通常是在生理芯片的基础上掺入病理因素，如肿瘤细胞或疾病相关因子等［47］。较为常见的病理芯片就是共培养肿瘤细胞/肿瘤球体和内皮细胞的肿瘤芯片，通常会在芯片上形成血管化的肿瘤球，以此来模拟肿瘤微环境（TME）。

Wang 等［48］报告了一种微流控芯片肿瘤微血管系统（TVOC），整合了肿瘤部位渗漏的血管系统和肿瘤部位致密的细胞外基质（图4）。芯片主要分为上通道和下通道两个部分，上下通道之间通过多孔聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜隔开。上通道是矩形中空通道，HUVEC 附着在中空通道内壁生长、汇合形成血管系统。使用细胞因子（TNF-α）刺激血管系统，形成更符合肿瘤部位实际情况的渗漏血管。下通道中合并了多个SKOV3肿瘤球和凝胶基质，用于模拟细胞外基质（ECM）。文中合成了靶向叶酸受体的脂质体（FA-脂质体）和PEGPLGA NP（FA-PLGA NP），并且和非靶向NP进行对比，发现靶向和未靶向NP 均未显示明显的细胞摄取差异。该系统模拟了增强的通透性和保留（EPR）效应过程中两个重要的生理屏障，以此来预测纳米颗粒在肿瘤部位的蓄积。TVOC 可以同时培养多个3D 肿瘤球，可供检测使用的样本量扩大。但是它也存在相应的不足，血管系统和肿瘤球没有直接接触、融合，没有形成血管化的肿瘤球，两者之间的联系不够紧密，无法探究肿瘤的内部渗透情况。

Figure 4 Microfluidic chip for forming the tumor-vasculature[48]A:In vivo tumor microenvironment consists of leaky vasculature and tumor tissues;B:Constituent elements of the in vitro tumor-vasculature-on-a-chip(TVOC)model

为了克服这些不足，Paek 等［49］提出了一种更贴近人体真实情况的微工程3D 血管系统（图5）。该芯片主要由两个部分构成，分别是中间细胞培养室（开放式腔室设计）和两侧通道。该系统通过整合不同类型的细胞，可开发成不同的模型。其中，为了构建血管化人肺腺癌模型，进行了以下操作：（1）两个侧面通道预留，提前共培养人肺腺癌细胞（A549）和内皮细胞（HUVEC）形成复合瘤球；（2）中间细胞培养室注入混悬内皮细胞、成纤维细胞、复合瘤球的水凝胶溶液，孵育胶凝；（3）侧面通道贴壁培养HUVEC 形成血管，中间细胞培养室中成纤维细胞诱导内皮细胞形成小血管，且可与侧面通道血管吻合。内皮细胞形成的脉管系统和肿瘤球之间有机结合，模型构建成功之后，使用紫杉醇作为模型药物，评估了该模型用于体外筛选抗肿瘤药物的可行性以及探索了紫杉醇的血管毒性。该平台拓宽了微流控芯片的使用范围，也增加了模具设计的多样性。

同样的，Nashimoto 等［50-52］以成纤维细胞作为诱导内皮细胞迁移的基质细胞设计了血管化的肿瘤芯片，用于探究灌注对肿瘤球体生长和药物输送的影响。该芯片由3 个通道构成，通道1 和3 主要用于内皮细胞种植和流体灌注，通道2底部存在1 个球形凹面，顶部存在圆形加样孔，用于加载肿瘤球体并且可固定瘤球位置。在构建单细胞瘤球（肿瘤细胞）和共培养瘤球（肿瘤细胞+成纤维细胞）的基础上，形成了三培养球体（肿瘤细胞+成纤维细胞+内皮细胞）。该研究首次通过灌注培养提高了血管网络和肿瘤球体的增殖活性，并且研究了紫杉醇的不同剂量在灌注条件下对肿瘤球体的影响，该模型平台可以拓展应用于药物筛选。

Figure 5 Microfluidic chip for generating vascularized tumor constructs[49]A: Schematic of mimic malignant solid tumors in the lung; B: Cancer spheroids composed of A549 cells (green) and RFP-HUVECs (red)grow in size during culture and integrate with the surrounding vasculature. Scale bar=50 μm

另外，为了在体外肿瘤芯片上获得更多的生物信息，越来越多的研究使用微流控芯片联合检测系统，基于此更好地捕捉病理状态下复杂的变化。Carvalho 等［53］构建了一种结直肠癌芯片系统，并且集成了实时成像系统（图6）。中间细胞培养室注入均匀分散在水凝胶（matrigel）中的结直肠癌（CRC）细胞用于模拟实体瘤，侧面通道种植了人结肠微血管内皮细胞（HCoMECs）形成血管系统。通过在侧面通道灌注用荧光标记的CMCht/PAMAM 树状聚合物纳米颗粒，可以观察到梯度的形成，基于此可以在肿瘤芯片上评估出纳米药物的渗透能力以及肿瘤细胞对于不同浓度纳米药物的响应。因为中间细胞培养室具有空间较大的优点，可以容纳更多的肿瘤细胞，从而可以获得更多的样品来满足不同的检测需要。在基因水平对给药后的肿瘤细胞进行分析，可以观察到研究基因（MMP-1，Caspase-3 和Ki-67）的下调。这种肿瘤芯片为纳米医学的精准治疗提供了一个新的思路，是个性化治疗方面的重要进展。Lee 等［35］构建了一种3D 血管再生的微流控肿瘤芯片，在体外重现了肿瘤微环境中的血管再生，用于筛选抗肿瘤血管再生的纳米药物，初步确定药物的作用范围和作用机制。然后再结合CUBIC（clear，unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis）的组织清除技术，对小鼠皮下肿瘤的整个肿瘤血管系统进行准确成像，基于动物模型进一步评估纳米药物的抗血管再生作用。结合3D 微流控平台和3D 体内肿瘤血管成像系统，旨在更准确地评估纳米药物的分布和疗效。

Figure 6 Microfluidic chip established for simulating microvascular 3D microenvironment of colorectal tumor [53]HCT-116(CRC cells,red),HCoMEC(yellow)

综上所述，血管化器官芯片可以很好地模拟出不同状态下的生理和病理过程，通过灌注给药可模拟药物在体内循环过程以及在特定部位的蓄积。特别是血管化肿瘤芯片可以为开发新的肿瘤疗法（尤其是纳米药物）提供一种新型手段，在体外通过集成检测系统（如实时成像系统等），可以更好地细化相应疗法的作用范围和作用机制，给探索疗法的器官特异性和肿瘤异质性响应提供了可能性。

3 血管化器官芯片的优势与待解决的问题

血管化器官芯片作为一种新型体外模型，具有诸多优势，表现在4个方面：其一，集成了灌注系统（连续灌注、双向灌注等）的血管化器官芯片优于普通的静态模型，血管系统中流体流动形成的剪切力、物理和化学梯度等，可以更加贴近体内的动态环境。其二，通过复制不同的体内过程，可在体外控制单因素变量，便于人们更好地理解生长发育过程以及疾病发生发展。其三，相比于不同肿瘤都使用相同的模型（如2D 细胞、动物皮下肿瘤模型）去检测药物活性，血管化器官芯片提供了个性化的检测手段。并且可以共培养器官特异性的相关细胞，可在一定程度上解决动物模型和人类之间存在的异源性问题。其四，因为微流控芯片的可视性和易取样的特点，便于收集在不同时间和空间的不同样品，有利于进行后续的分子、细胞、标志物、基因等的分析。

血管化器官芯片目前也存在着一些尚待解决的问题，表现在4个方面：其一，构建血管化器官芯片的关键在于准确模拟出体内复杂的生理或病理学环境，所以在体外模型构建完成之后，还需要验证模型的有效性和可靠性，这种验证还需要指定一系列的标准，目前缺乏这样的标准。其二，血管化器官芯片上体外模型的构建，比起普通常用的体外模型，操作更难也更不好普及，特别是比较难以实现高通量的筛选。因此，如何保证可重复性高，是一个巨大的挑战。其三，现行微流控芯片趋向于往更复杂的方向上发展，集成诸多因素（多种细胞、多种培养模式、不同细胞因子、流体系统等），如何控制多种因素之间的相互作用才能实现最佳的性质和功能，这也是一个挑战。目前构建的血管化器官芯片，还缺乏一些人们更加关注的因素，比如免疫细胞（如，巨噬细胞）。其四，制造器官芯片常用的材料PDMS，被证明对小分子存在非特异性吸收［10］，会带来定量测定的不准确性，需要开发出新的材料和手段解决这个问题。

4 总结和展望

血管化器官芯片自出现以来，发展出许多具有复杂结构的模型。这些芯片可模拟同种生理或病理过程，或是一种结构的芯片加以微小的改造可用来模拟多种生理或病理过程，都旨在模拟出体内最真实的环境。本课题组致力于开发微流控芯片上的血管化肿瘤球模型，用于评估纳米颗粒在肿瘤处的分布和疗效。在构建准确度高、重现性高的体外模型的基础上，将模型应用于纳米颗粒在实验室阶段的筛选过程，从而增加纳米颗粒体外评价方法的多样性和准确性。

血管化器官芯片在药物发现和开发领域存在着巨大潜力，相比于目前的动物模型，可以更准确地预测临床试验结果。在临床前药物开发阶段，可以使用芯片对于药物的作用机制、可能存在的毒性等进行深入探究，并且可以与体内结果形成对比，用以综合评估药物。血管化器官芯片也为个性化治疗提供了更多的可能，通过在芯片中培养正常人体或者患者来源的细胞和组织，可以进行针对特定群体或个人的特异性药物评估，这在一定程度上可以解决疾病异质性（如肿瘤异质性）问题。血管化器官芯片还可以为现阶段存在开发困难的药物提供一个新的解决途径，如孤儿药等，这些药物的开发存在疾病罕见、患者样本量少、药物研发伦理学等问题，使用芯片培养体外模型，给此类药物的开发提供了便利和更多的可能性。

血管化器官芯片集成了血管系统和机械线索等诸多因素，可以在时间和空间上都高分辨率地观察到分子、细胞、器官水平的真实响应。通过集成不同的系统，扩大和完善芯片的应用范围，具有传统体外系统无法比拟的优势。虽然目前也存在需要克服的问题，但是经过先进技术的发展和整个体系的改善，有望提高芯片上体外模型的准确性和耐用性等。目前也有许多芯片进入商业化阶段［54］，期望该技术能够在实验室和临床应用方面发挥出应有的作用。