HPLC标准曲线法测定氟康唑杂质校正因子的测量不确定度评定

肖 亭，马步芳，王 晨，姚尚辰，冯艳春，宁保明

（中国食品药品检定研究院，北京 102629）

相对校正因子（简称校正因子）［1］，又称响应因子［2］，是药典质量标准中应用HPLC 法进行杂质控制的关键参数。杂质对照品往往不易获得、价格昂贵或数量有限，是药品研发、质控经常面临的难题。采用加校正因子的主成分自身对照法进行杂质的定量，由于省去了杂质对照品，同时又考虑了杂质与主成分响应因子不同所引入的测定误差［3］，显著提高了杂质定量的准确性，因此，校正因子的准确测定是实现杂质准确定量的前提。测定杂质校正因子的方法有配置紫外检测器的HPLC 单点法、多点法、标准曲线法；HPLC 与紫外检测器和其他质量型检测器联用等多种方法［4］。目前最常用的方法为HPLC 标准曲线法，即主成分和杂质标准物质线性溶液浓度与峰面积的线性回归方程的斜率之比为该杂质的校正因子，该方法也是目前文献报道最多的方法［5-7］，这些报道多集中于研究某个杂质时应用该方法进行杂质校正因子的测定，对于测定过程中各环节以及各因素对校正因子测定结果准确性的影响考察较少。

测量不确定度（简称不确定度）是根据所用到的信息，表征赋予被测量量值分散性的非负参数［8］，它是对测量结果可疑程度的一种定量表述，是实验室提高检测结果可靠性的重要保障，对不确定度来源进行分析和评定，可以找出导致实验误差的原因，减少不确定度可以有效提高测定结果的准确度，是质量控制的一个重要手段［9］。本课题组曾以目前国际上测量不确定度评定的经典方法——GUM 法为基础对HPLC 标准曲线法测定利奈唑胺杂质I 校正因子进行测量不确定度评定［10］，建立了HPLC标准曲线法测定杂质校正因子的不确定度评定方案，给出数学模型及各不确定度分量的计算公式，并对测定过程中各环节对于校正因子结果准确性的贡献进行了初步的评价，但评价结果只是针对利奈唑胺杂质I 校正因子的测定过程，其各环节影响大小对标准曲线法测定杂质校正因子是否具有普遍性指导意义有待进一步研究。

氟康唑是一种广谱三唑类抗真菌药物，对深部真菌感染疗效显著，是WHO 指定的治疗全身性真菌感染的首选药物［11］。本研究以氟康唑原料及其6 个杂质（杂质A、B、C、D、F、I）为例，采用文献［10］建立的不确定度评定方案，对HPLC 标准曲线法测定这6 个杂质校正因子的测定过程进行不确定度评定，并计算比较各影响因素的贡献率，尝试总结出影响HPLC 标准曲线法测定杂质校正因子准确性的主要因素，从而帮助实验人员在从事类似工作时更好地制定实验方案，保障结果的准确性。

1 材 料

1.1 药品与试剂

实验所用氟康唑及其杂质A、B、C、D、F、I对照品（批号：130693-201501、130694-201501、130695-201501、130696-201501、130697-201501、130699-201501，含 量：99.7%、99.0%、94.6%、99.4%、99.6%、99.5%、99.1%，中国食品药品检定研究院）；乙腈（批号197811，色谱级，美国赛默飞世尔公司）；甲酸铵（批号20190524，含量≥96.0%，国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪 器

Alliance 2695 HPLC 色谱仪，PAD 检测器（美国 沃特世 公司）；Capcell pak MG ⅡC18色 谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm，Cat. No. 92533，日本资生堂公司）；XP205型电子天平（美国梅特勒公司）。

2 方 法

2.1 氟康唑杂质校正因子的测定

选取各杂质定量限至限度水平150%浓度范围内LOQ、限度水平20%、60%、100%、150%5点配制各杂质及相应氟康唑的线性溶液，按《中华人民共和国药典》（2020 版）中氟康唑色谱系统进样，应用最小二乘法以峰面积A 为纵坐标，样品浓度c 为横坐标进行直线拟合，氟康唑及杂质分别获得一条拟合直线，以斜率比计算氟康唑各杂质校正因子。计算公式如公式（1），其中f 为杂质相对于主成分（API）的校正因子；K 分别为两条拟合直线的斜率，其计算公式见公式（2），ci为各个线性溶液的浓度，Ai为各溶液浓度对应的峰面积，cˉ为线性溶液浓度的平均值，为峰面积的平均值（以下同）。

2.2 氟康唑杂质校正因子测定过程不确定度的评定

参考文献［10］，基于GUM 法的HPLC 标准曲线法测定杂质校正因子的不确定度评定方案基本流程如图1所示。

Figure 1 Evaluation scheme diagram of uncertainty of impurity correction factor determined by HPLC standard curve method

首先建立校正因子测定过程的不确定度测量模型［公式（3）］，其中f'rep为重复性实验对测量结果的影响所引入的修正因子；将HPLC 标准曲线法测定杂质校正因子的不确定度归为3 个分量［公式（4）］，即主成分线性方程斜率引入的不确定度urel（KAPI）、杂质线性方程斜率引入的不确定度urel（KImp）和校正因子测定重复性引入的不确定度urel（f'rep），其中主成分和杂质线性方程斜率引入的不确定度［公式（5）］主要来源为直线拟合过程u（KA）［公式（6），A 类不确定度评定］、线性浓度溶液的配制u（KB1）［公式（7）～（9），B 类不确定度评定］和溶液峰面积的测定u（KB2）［公式（10）～（12）、B 类不确定度评定］；校正因子测定重复性引入的不确定度urel（f'rep）来源为n次测定结果均值的标准偏差［公式（13），A 类不确定度评定］；接着将各不确定度分量合成得到杂质校正因子的相对标准不确定度urel（f）；相对标准不确定度乘以包含因子k得到相对扩展不确定度Urel（f）［公式（14）］，最后乘以校正因子测定结果得标准曲线法测定杂质校正因子的扩展不确定度［公式（15）］。

另外，本实验继续引入贡献率的计算公式（16）用以评价不确定各分量对于最终不确定度结果的影响。贡献率越大，说明该因素引入的不确定度越大。

3 结果与讨论

3.1 对测定重复性引入的不确定度urel(f'rep)的评定

由于实验篇幅的限制，本研究以氟康唑杂质A为例，详细介绍杂质校正因子测量不确定度的评定过程。杂质A 校正因子重复性测定结果见表1。根据贝塞尔标准偏差计算公式，5 次测定结果均值的标准偏差s（fˉ）= 0.003 16。由于测量次数偏少，由贝塞尔公式计算得到的实验标准差并不直接作为标准不确定度，须先乘以安全因子h后再作为标准不确定度［10］。查表得，n = 5 时，h =1.4，u（f'rep）= h× s（fˉ）= 0.004 43。由随机误差引入的修正因子的数学期望等于1，所以f'rep= 1，根据公式（13），校正因子测定重复性引入的相对标准不确定度为urel（f'rep）=0.004 43。

Table 1 Repeated determination of correction factor of fluconazole impurity A

3.2 对直线拟合过程引入的不确定度u(KA)的评定

氟康唑-A（杂质A 对应的主成分）及杂质A 标准溶液各浓度点对应的峰面积见表2。氟康唑-A拟合直线方程为A=2 442.7c+493.2，R2=0.999 2；杂质A拟合直线回归方程为A=2 314.3c+509.7，R2= 0.999 9。根据公式（6）计算氟康唑-A 及杂质A 线性方程直线拟合过程引入的标准不确定度u（KA）分别为40.517和12.599。

3.3 线性系列浓度溶液配制过程引入的不确定度u(KB1)的评定

根据公式（7）～（9），氟康唑-A 及其杂质A 线性方程斜率拟合中溶液浓度引入的标准不确定度u（KB1）分别为16.248 和15.466，计算结果如表3、表4所示。

Table 2 Concentrations of fluconazole-A and impurity A standard series solutions and their corresponding peak areas

3.4 线性系列溶液峰面积引入的不确定度u(KB2)的评定

根据公式（10）～（12），氟康唑-A 及其杂质A线性方程斜率拟合中溶液峰面积引入的标准不确定度u（KB2）分别为11.131 和10.502。计算结果如表5、表6所示。

3.5 标准曲线法测定氟康唑杂质校正因子的合成不确定度的计算

根据公式（5）和上述计算结果，氟康唑-A 及其杂质A 拟合直线斜率引入的相对标准不确定度urel（K）分别为0.018 4 和0.009 75。根据公式（4），标准曲线法测定氟康唑杂质A 校正因子的相对合成标准不确定度urel（f）= 0.021 3。取置信概率为95%，包含因子k = 2，根据公式（14）～（15）得标准曲线法测定氟康唑杂质A 校正因子的相对扩展不确定度Urel（fImpA）= 0.042 6，扩展不确定度U（fImpA）= 0.045 5。因此，HPLC 标准曲线法测定氟康唑杂质A 校正因子为：fImpA= 1.068 ±0.046，k=2。

3.6 贡献率的计算与结果比较分析

按照上述计算过程，分别对其他5个杂质的校正因子测定过程进行了不确定度评定，得到氟康唑杂质A、B、C、D、F、I 校正因子分别为1.068 ±0.046，0.102 ± 0.005，0.058 2 ± 0.003，1.382 ±0.121，0.802±0.067 和1.383±0.119，数值跨度较大，具有一定的代表性，因此尝试对各个杂质的不确定度评定过程进行横向比较，寻找影响标准曲线法测定杂质校正因子过程的关键环节。

3.6.1 比较对象的确定 由于各不确定度来源的标准不确定度u 的计算结果与各杂质及相应主成分的溶液配制过程、峰面积响应大小等因素有关，所以不同的杂质即使是相同的不确定度分量，其计算结果也会有所差别。贡献率反映了在合成不确定度中各不确定度分量的占比，消除了数据量纲的影响，使数据指标之间具有了可比性，如杂质C 与其相应主成分氟康唑-C 峰面积响应差别较大，两者峰面积的标准不确定度分别为176.952和11.614，但两者峰面积标准不确定度的贡献率均约为6%。因此通过计算不确定度分量中各来源引入的不确定度的贡献率和各不确定度分量在合成不确定度中的贡献率，可得到在该杂质校正因子测定过程中各影响因素对实验结果的影响占比，从而找出影响该杂质校正因子准确性的最大因素。

Table 3 Calculation of standard uncertainty introduced by concentrations of fluconazole-A linear solutions

Table 4 Calculation of standard uncertainty introduced by concentrations of impurity A linear solutions

Table 5 Calculation of standard uncertainty introduced by peak areas of fluconazole-A linear solutions

Table 6 Calculation of standard uncertainty introduced by peak areas of impurity A linear solutions

3.6.2 测定重复性不确定度分量urel(f'rep)的贡献率 测定重复性表示在测定过程中由人员观测、仪器、环境等随机效应带来的不确定分量，从实验结果可知杂质A、B、C、D、F、I校正因子测量不确定度中测定重复性的不确定度贡献率均最小，分别为4.3%、1.1%、1.1%、12.7%、1.6%、5.3%，说明在实验中随机误差对实验结果的影响较小。

3.6.3 线性方程斜率不确定度分量urel(K)的贡献率 氟康唑杂质A ～I校正因子测定相对合成标准不确定度urel（f）中，主成分和杂质的线性方程斜率的urel（K）贡献率之和占比均大于85%，计算结果见表7，说明在杂质校正因子测定过程中主成分和杂质线性方程斜率的计算是影响实验结果的主要因素。除杂质A 外，主成分和杂质的urel（K）贡献率之比均约为1∶1，说明主成分和杂质的线性方程斜率对校正因子的影响效果相当。但杂质A 校正因子不确定度的主成分和杂质的urel（K）贡献率之比相差较大（74.8%vs 20.9%），进一步比较发现在杂质A 校正因子的测定过程中，其对应的主成分氟康唑-A 直线拟合引入的不确定度贡献率相对较高为79.3%，约为杂质A 直线拟合引入的不确定度贡献率（31.2%）的2.5 倍，比较两者拟合直线的判定系数R2分别为0.999 2 和0.999 9，说明氟康唑-A 比杂质A 拟合效果差，人为提高氟康唑-A 拟合直线的R2至0.999 9后，计算氟康唑-A 直线拟合过程引入的标准不确定度的贡献率由79.3%降低至28.7%，与杂质A 的31.2%相当，urel（KFluconazole-A）和urel（KImpA）的贡献率分别变为44.3%和46.2%，说明氟康唑-A 与杂质A 拟合效果差别较大是导致杂质A 的urel（KFluconazole-A）和urel（KImpA）贡献率差别较大的原因，且拟合效果越好，引入的不确定度越小，对测定结果造成的影响也越小。

Table 7 Contribution rate (CR)of uncertainty introduced by the slope of the linear equation of principal component and impurity and the sum of their contribution rates

3.6.4 线性方程斜率不确定度分量urel(K)中各来源引入不确定度的贡献率 线性方程斜率不确定度分量urel（K）中各来源引入不确定度的贡献率计算结果如表8所示。

（1）在线性方程斜率不确定度urel（K）中，6 个杂质对应6 个主成分共12 组数据，其中8 组数据溶液浓度不确定度贡献率占比在80%以上，说明溶液浓度是线性方程斜率的最大影响因素。溶液浓度的不确定度主要来源于称量、对照品含量、量瓶和移液管，其中由对照品含量在溶液浓度中引入的不确定度贡献率约为80%，各杂质线性溶液中各不确定度来源贡献率计算结果见表9，说明对照品含量是溶液浓度的主要影响因素，进而也是影响标准曲线法校正因子测定准确性的最大因素。目前化学药品对照品的不确定度约在2%左右［12-13］，而化学药品杂质对照品的含量较主成分对照品含量的准确性更低，不同方法的测定偏差可高达约5%［13］，因此，校正因子测定中杂质对照品含量的准确性更是影响结果准确性的关键。

Table 8 Contribution rate of uncertainty introduced by various sources in the uncertainty introduced by the slope of the linear equation

Table 9 Calculation results of the contribution rates of the sources of uncertainty in the preparation of linear solution of each impurity

（2）在12组数据中，杂质A 及其对应的主成分氟康唑-A、杂质B及其对应的主成分氟康唑-B 4 组数据的线性方程斜率不确定度urel（K）中溶液浓度占比在80%以下，且氟康唑-A、杂质B、氟康唑-B 3 组数据的直线拟合过程不确定度贡献率占比最大，通过横向比较分析可能有如下原因：（1）氟康唑-A、杂质B、氟康唑-B 三者的线性方程R2分别为0.999 2、0.999 1、0.999 4，拟合效果虽已达到要求但相较于其他物质拟合效果相对较差，各杂质及相应主成分线性方程R2如表10所示，相比其他杂质，杂质A及主成分氟康唑-A、杂质B及主成分氟康唑-B线性溶液浓度较宽（杂质A：LOQ ～60 μg/mL；杂质B：LOQ ～45 μg/mL；杂质C：LOQ ～22.5 μg/mL；杂质D、F、I：LOQ ～15 μg/mL）可能容易导致线性拟合较差，因此三者的直线拟合过程引入的不确定度的贡献率占比大于其他物质，直线拟合过程对校正因子测定结果的影响也大于其他物质；（2）杂质A及其主成分氟康唑-A、杂质B及其主成分氟康唑-B 线性系列溶液配制过程所用量瓶和移液管总次数最少，均为17 次，杂质C 及氟康唑-C 共计28次，杂质D、F、I 及相应主成分均共计26 次，所以相较于其他物质，杂质A 及氟康唑-A、杂质B 及氟康唑-B 线性溶液浓度引入的不确定度较小，其贡献率也较低，同时也提高了直线拟合过程和峰面积的不确定度贡献率占比，因此杂质A 的urel（KImpA）中即使直线拟合R2为0.999 9，直线拟合过程的不确定度贡献率也高于其他杂质，溶液浓度的不确定度贡献率也低于80%，峰面积的不确定度贡献率也高于其他杂质。

Table 10 Determination coefficient of the fitting equation of principal component and impurity and the contribution rate of uncertainty introduced by the fitting process

4 结 论

通过上述研究发现，当直线拟合程度良好（R2＞0.999 5）时，标准曲线法测定杂质校正因子的过程中，线性溶液浓度的配制影响最大，其次是直线拟合过程；在线性溶液浓度配制过程中，对照品的纯度是最显著的影响因素，其次是称量和移液次数，该结论与前期研究工作结论［10］基本一致，证明其在标准曲线法测定杂质校正因子的过程中具有一定的普适性。因此，建议在标准曲线法测定杂质校正因子的过程中，为保障校正因子测定的准确性，应尽量选用高纯度的对照品、高精度仪器设备，并尽量减少实验过程中量瓶使用的个数和移液次数，更好的保障溶液浓度的准确性，提高拟合效果。当直线拟合程度略差（0.999 0 ＜R2＜0.999 5）时，直线拟合过程对杂质校正因子测定结果的影响，可能超过线性溶液浓度的影响，成为最主要的影响因素；在上述情况下，应尽可能通过调节线性溶液浓度范围、提高实验人员操作水平等实验方案设计的优化，提高拟合效果，减小直线拟合对实验结果的影响。