阿嗪米特原料药中潜在基因毒性杂质氯乙酰氯和氯乙酸的含量测定

周 玉，倪卫星，刘 勇，黄鹏飞，苏梦翔，3，4*

（1中国药科大学药学院，南京 210009；2扬州一洋制药有限公司，扬州 225600；3药物质量与安全预警教育部重点实验室（中国药科大学），南京 210009；4国家药品监督管理局药物制剂及辅料研究与评价重点实验室，南京 210009）

酰氯类化合物是药物合成过程中重要的酰化剂。其代表性物质氯乙酰氯（chloroacetyl chloride）具有极强的酰化能力，被广泛运用于农药及他达拉非、双氯芬酸钠等的合成中［1-3］。氯乙酰氯化学性质极为活泼，遇水反应生成氯乙酸。尽管目前尚未有足够的证据证明氯乙酰氯和氯乙酸的基因毒性和致癌性，但其结构中含有警示结构——酰卤基团，因此这两种成分为潜在的基因毒性杂质［4］。

阿嗪米特（azintamide）是一种治疗因胆汁分泌不足或消化酶缺乏而引起的症状的药物［5-6］。氯乙酰氯是其合成的起始物料之一，因此有必要建立高灵敏度、专属性强的痕量定量检测方法来考察氯乙酰氯及其水解产物氯乙酸在阿嗪米特中的残留量。因氯乙酰氯的高反应活性和氯乙酸的强酸性，且缺乏检测响应结构，二者都无法通过高效液相色谱或气相色谱直接分析，故采取衍生化方法钝化其活性及改善色谱行为，成为分析这两种物质的常用方法。目前有文献报道测定酰氯类化合物较为常用的衍生化试剂主要有甲醇［7-9］、吖啶酮乙酰肼（荧光标记试剂）［10］、苯肼类物质［11］等，其中采用甲醇做衍生化试剂通过GC-MS 法测定的检测限能达到0.01 μg/mL，采用不同的衍生化试剂通过HPLC 法测定的检测限最低能达到0.02 μg/mL。氯乙酸是饮用水中的主要消毒剂副产物之一，针对检测水样中的卤乙酸建立了GC、离子色谱（IC）、HPLC 及这些色谱法与电感耦合等离子体质谱（MS/ICP）联用的分析方法［12-13］。与水样相比，药物具有更加复杂的基质，需要更灵敏、具有高度特异性的检测方法。目前有文献报道测定药物中氯乙酸较为常用的衍生化试剂主要有1-萘胺［14］、苯肼类物质［15］等，其检测限最低能达到0.02 μg/mL。

本课题组前期建立了阿嗪米特中潜在基因毒性杂质马来酰肼的液相-荧光分析方法［16］。本文在此基础上，建立了两种以2-硝基苯肼为衍生化试剂的柱前衍生化HPLC 法，分别检测阿嗪米特原料药中氯乙酰氯和氯乙酸。反应原理见图1、图2。所建立的方法与文献相比，解决了衍生化反应稳定性的同时提高了检测的灵敏度，氯乙酰氯和氯乙酸的检测限分别为7.5 ng/mL和15 ng/mL。方法成功运用于阿嗪米特原料药中潜在基因毒杂质氯乙酰氯和氯乙酸的检测。

Figure 1 Overview of the reaction between 2-nitrophenylhydrazine and chloroacetyl chloride

Figure 2 Overview of the reaction between 2-nitrophenylhydrazine and chloroacetic acid

1 材 料

1.1 仪 器

1260 型高效液相色谱仪配紫外检测器、Waters Empower网络版工作站（美国安捷伦科技公司）；XPR10 型电子天平（瑞士梅勒特托利多公司）；MSE125P 型电子天平（德国Sartorius 公司）；PL5242 型超纯水仪（美国Pall 公司）；Centrivap 真空离心浓缩仪（美国Labconco 公司）；MixMate 涡旋仪（德国Eppendorf 公司）；KH-3200DB 型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

氯乙酰氯对照品（美国QCC 公司）；氯乙酸对照品（德国Sigma 公司）；阿嗪米特原料药（批号：160003、160009、170004、170005、180010、180020、190001、190012、190023、190024、190025）（扬州一洋制药有限公司）；2-硝基苯肼［阿拉丁试剂（上海）有限公司］；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl，阿拉丁试剂有限公司）；1-羟基苯并三唑（HOBT，上海吉尔生化有限公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为市售分析纯。

2 方 法

2.1 氯乙酰氯检测

2.1.1 色谱条件 以Thermo syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以0.1%磷酸水-乙腈（74：26）（A）-乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱（0～18 min，100%A；18～19 min，100%A→15%A；19 ～29 min，15%A；29 ～30 min，15%A→100%A；30～45 min，100%A）；柱温40 ℃，检测波长226 nm；流速1 mL/min；进样量50 μL。

2.1.2 溶液的配制

空白溶剂：取适量二氯甲烷于10 mL 量瓶，静置反应40 min后，取500 μL挥干，加入乙腈500 μL复溶，加入水500 μL，涡旋混匀后即得空白溶剂。

衍生化试剂：取2-硝基苯肼20 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加二氯甲烷适量溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每毫升含2-硝基苯肼2 mg 的2-硝基苯肼溶液。取适量二氯甲烷于10 mL量瓶，加入2-硝基苯肼溶液（2 mg/mL）100 μL，摇匀，加入二氯甲烷定容。静置反应40 min后，取500 μL挥干，加入乙腈500 μL复溶，加入水500 μL，涡旋混匀后即得空白衍生化试剂。

对照品溶液：加适量乙腈于1 mL量瓶中，精密称定氯乙酰氯3 mg于量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到每毫升含氯乙酰氯3 mg的溶液。取上述溶液100 μL 于20 mL 量瓶，用二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，制成每毫升含氯乙酰氯15 μg 的氯乙酰氯溶液。

限度浓度对照品溶液：取适量二氯甲烷于10 mL 量瓶中，加入2-硝基苯肼溶液（2 mg/mL）100 μL，摇匀，加入上述对照品溶液100 μL 后，加入二氯甲烷定容。静置反应40 min 后，取500 μL挥干，加入乙腈500 μL 复溶，加入水500 μL，涡旋混匀后制成每毫升含氯乙酰氯150 ng 的限度浓度对照品溶液。

含限度浓度杂质的供试品溶液：取阿嗪米特原料药约500 mg，精密称定，置于10 mL 量瓶中，加适量二氯甲烷超声溶解，加入上述对照品溶液100 μL，摇匀，加入2-硝基苯肼溶液（2 mg/mL）100 μL 后，加入二氯甲烷定容。静置反应40 min后，取500 μL 挥干，加入乙腈500 μL 复溶，加入水500 μL，涡旋混匀后制成每毫升含氯乙酰氯150 ng的含限度浓度杂质的供试品溶液。

供试品溶液：取阿嗪米特原料药约500 mg，精密称定，置于10 mL 量瓶中，加适量二氯甲烷超声溶解，加入2-硝基苯肼溶液（2 mg/mL）100 μL，摇匀，加入二氯甲烷定容。静置反应40 min 后，取500 μL 挥干，加入乙腈500 μL 复溶，加入水500 μL，涡旋混匀后即得供试品溶液。

2.2 氯乙酸检测

2.2.1 色谱条件 以Thermo syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以0.1%磷酸水-乙腈（72∶28）（A）-乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱（0～18 min，100%A；18～19 min，100%A→15%A；19～29 min，15%A；29～30 min，15%A→100%A；30～40 min，100%A）；柱温40 ℃，检测波长226 nm；流速1 mL/min；进样量20 μL。

2.2.2 溶液的配制

空白溶剂：乙腈-水（70∶30）。

衍生化试剂：取2-硝基苯肼约200 mg，精密称定，置20 mL 量瓶中，加空白溶剂适量溶解并稀释至刻度，得到每毫升含2-硝基苯肼10 mg 的2-硝基苯肼储备液。取EDC·HCl约400 mg，精密称定，置20 mL 量瓶中，加空白溶剂适量溶解并稀释至刻度，得到每毫升含EDC·HCl 20 mg 的EDC·HCl 储备液。取HOBT 约400 mg，精密称定，置20 mL 量瓶中，加空白溶剂适量溶解并稀释至刻度，得到每毫升含HOBT 20 mg的HOBT储备液。取适量空白溶剂于10 mL 量瓶，加入2-硝基苯肼溶液（10 mg/mL）0.8 mL，EDC·HCl 溶液（20 mg/mL）0.25 mL，HOBT 溶液（20 mg/mL）0.25 mL，摇匀，加入空白溶剂定容，静置反应60 min后制成空白衍生化溶液。

对照品溶液：精密称定氯乙酸20 mg 于20 mL量瓶中，用空白溶剂溶解并稀释至刻度，得到每毫升含氯乙酸1 mg 的氯乙酸溶液。取上述溶液150 μL 于10 mL 量瓶，用70%乙腈稀释至刻度，得到每毫升含氯乙酸15 μg的氯乙酸溶液。

限度浓度对照品溶液：取适量空白溶剂于10 mL 量瓶中，加入2-硝基苯肼溶液（10 mg/mL）0.8 mL，EDC·HCl 溶 液（20 mg/mL）0.25 mL，HOBT 溶液（20 mg/mL）0.25 mL，摇匀，加入上述对照品溶液100 μL后，加入空白溶剂定容，静置反应60 min 制成每毫升含氯乙酸150 ng 的限度浓度对照品溶液。

含限度浓度杂质的供试品溶液：取阿嗪米特原料药约500 mg，精密称定，置于10 mL 量瓶中，加适量空白溶剂超声溶解，加入2-硝基苯肼溶液（10 mg/mL）0.8 mL，EDC·HCl 溶 液（20 mg/mL）0.25 mL，HOBT 溶液（20 mg/mL）0.25 mL，摇匀，加入上述对照品溶液100 μL 后，加入空白溶剂定容，混匀后静置反应60 min 制成每毫升含氯乙酸150 ng的含限度浓度杂质的供试品溶液。

供试品溶液：取阿嗪米特原料药约500 mg，精密称定，置于10 mL 量瓶中，加适量空白溶剂超声溶解，加入2-硝基苯肼溶液（10 mg/mL）0.8 mL，EDC·HCl 溶 液（20 mg/mL）0.25 mL，HOBT 溶 液（20 mg/mL）0.25 mL，摇匀，加入空白溶剂定容，涡旋混匀后静置反应60 min即得供试品溶液。

3 结果与讨论

3.1 方法学验证

根据上述方法分别进行方法学验证，结果显示，空白溶剂、衍生化试剂及阿嗪米特均不干扰待测物质出峰（图3、图4）；氯乙酰氯和氯乙酸的检测限分别为7.5 ng/mL 和15 ng/mL，定量限均为30 ng/mL。在30 ～300 ng/mL范围内氯乙酰氯和氯乙酸的质量浓度与色谱峰面积呈现良好的线性关系。线性回归方程分别为y=471.3x-3 029.2（r=0.995 7）和y=239.81x+2.029 4（r=0.997 9）；加样回收率在87.37%～109.75%范围内。进样精密度峰面积的RSD 分别为1.83%、0.98%；重复性含量的RSD 分别为4.25%、1.30%；中间精密度含量的RSD分别为13.77%、2.29%；溶液均在36 h内稳定；加样回收率在87.37% ～109.75%范围内；方法耐用性良好。各项数据均符合验证方案要求，因此本研究建立的两种方法适用于阿嗪米特原料药。

3.2 样品的测定

取11 批阿嗪米特原料药，分别按“2.1.2”和“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”和“2.2.1”项下色谱条件分别进样测定，记录峰面积并以外标法计算氯乙酰氯和氯乙酸含量。结果显示，11 批阿嗪米特原料药中均未检出氯乙酰氯和氯乙酸。

Figure 3 HPLC chromatograms of chloroacetyl chloride specificity tests1: Chloroacetyl chloride. A: Blank solution; B: Blank derivatization solution; C: Limit concentration reference solution; D: Test solution; E:Test solution containing limit concentration impurities

Figure 4 HPLC chromatograms of chloroacetic acid specificity tests2: Chloroacetic acid. A: Blank solution; B: Blank derivatization solution;C:Limit concentration reference solution;D:Test solution;E:Test solution containing limit concentration impurities

3.3 讨 论

3.3.1 限度的确定 根据ICH M7（R1）中对多个致突变杂质的可接受摄入量提出的规定，毒理学关注阈值（TTC）的可接受摄入量适用于每个单杂，如果有两个2 类或3 类杂质，应制定各自限度。对于临床研发和已上市的药品，如果原料药质量标准中有3 个或更多2 类或3 类杂质，应按照多个杂质的可接受总摄入量制定总致突变杂质限度［17］。尽管尚无充足证据证明氯乙酰氯和氯乙酸的致癌性，但其结构中含有警示结构“酰卤基团”，对非目标生物的毒性尚未确定。因此本研究参考遗传毒性杂质的分类中第二类物质使用TTC 分别对氯乙酰氯和氯乙酸进行限度控制［17］，同时结合复方阿嗪米特说明书中每日最大剂量为450 mg，可得氯乙酰氯与氯乙酸的可接受限度=1.5（μg/d）/0.45（g/d）=3.33 μg/g。本研究将氯乙酰氯与氯乙酸的可接受限度分别定为3 μg/g。本研究所建立的两种方法的检测限分别为0.15 μg/g 和0.3 μg/g，远低于上述限度，通过本研究建立的方法对11 批阿嗪米特进行检测，均未检出氯乙酰氯和氯乙酸，表明11批阿嗪米特原料药中的氯乙酰氯和氯乙酸的含量均低于检测限，满足限度控制的要求。

3.3.2 检测方法的优化与确定 预实验中发现，文献中检测氯乙酰氯时选用乙腈作为反应溶剂［11］，乙腈与水混溶而氯乙酰氯极易与水反应，准确度无法满足要求。本研究选择二氯甲烷作为反应溶剂，优化了衍生化反应体系。考察了衍生化试剂2-硝基苯肼的用量及衍生化反应时间，为保证反应完全最终选定的最佳条件是在2-硝基苯肼的质量浓度为20 μg/mL 进行反应40 min。此外，研究发现复溶溶剂乙腈与水的比例对氯乙酰氯的峰形及响应产生影响：水相比例增大时色谱峰的响应变差（可能产物发生了水解），有机相比例增加时色谱峰峰形变差，经权衡优化最终选定乙腈-水（50∶50）作为复溶溶剂。

本课题组前期在研究氯乙酸时，采取与氯乙酰氯相同的衍生化方法进行检测未能够得到目标产物；参考文献在衍生化反应中加入缩合剂（EDC·HCl）检测氯乙酸［15］时，发现得到的衍生化产物量很少，紫外响应差，通过调整反应时间、反应温度、反应物比例等均未得到改善。本研究在加入酰化催化剂（HOBT）后使得该衍生化反应效率大幅提高，并且避免了副产物的产生。对反应物比例及反应时间进行了优化，确定了衍生化试剂、缩合剂及酰化催化剂比例为8∶5∶5，反应时间为60 min。

本研究建立的两种方法中的两待测物氯乙酰氯和氯乙酸的结构相近，且衍生化反应产物相同，考虑到氯乙酰氯在氯乙酸衍生化的条件下反应并可能产生干扰，笔者曾试过氯乙酰氯在氯乙酸衍生化的条件下的衍生化反应，得到了相同的衍生化产物。原因如下：氯乙酸的衍生化反应体系中含水，氯乙酰氯遇水先迅速转变为氯乙酸后，再与衍生化试剂继续反应，得到相同的衍生化反应产物。因此，反应并不干扰两者的测定。严格来讲，氯乙酸的衍生化测定结果包含了氯乙酰氯和氯乙酸的残留总量，而氯乙酰氯的衍生化方法仅检测氯乙酰氯。

本研究分别建立了两种不同的柱前衍生化HPLC-UV 方法检测阿嗪米特原料药中基因毒性杂质氯乙酰氯和氯乙酸，以3 μg/g为限度完成了完整的方法学验证及测样。方法学结果显示，本研究建立的两种方法灵敏度高、专属性好，能够准确测定阿嗪米特原料药中的氯乙酰氯和氯乙酸，可以为阿嗪米特原料药的质量控制提供参考。