养营活血汤对肝纤维化大鼠TGF-β1及上皮-间质转化过程的影响

梁 爽,周 波,马小丽,

肝纤维化是由多种慢性致病因素所致的进行性、弥漫性肝脏病变，发生的中心环节主要是肝星形细胞(HSC)的激活，HSC的激活可导致上皮-间质转化(EMT)的发生,EMT是可逆的，可通过调节相关通路来干预EMT的过程。转化生长因子β1(TGF-β1)可介导HSC和成纤维细胞的活化，进而导致细胞外基质(ECM)沉积；ECM沉积的来源也包括发生EMT的肝细胞与胆管细胞,抑制TGF-β1信号通路能有效阻止HSC的活化[1]。临床证实养营活血汤治疗肝纤维化临床有效率为92.5%[2],可降低大鼠血清TNF-α和IFN-γ含量，抑制NF-kB mRNA的表达，降低肝纤维化大鼠血清TGF-β1浓度及肝组织α-SMA的表达，直接或间接抑制了HSC的活化而改善肝组织的纤维化程度[3-5]。本研究探讨养营活血汤抗肝纤维化的作用机制，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选取清洁级SD大鼠60只，雄性，体重180～220 g。大鼠均使用消毒笼具分笼饲养，饲以标准大鼠合成饲料，饮用自来水，环境温度18～22 ℃，相对湿度40%～60%。

1.2 药物及试剂

1.2.1 实验药物：养营活血汤由当归、川芎、熟地、白芍、党参、丹参、陈皮、茯苓、鳖甲、柴胡、炙甘草、大枣12味药物组成，所需中药均购自宁夏医科大学附属回医中医医院银川医院。用冷水浸泡中药40 min后，进行煎煮、过滤、浓缩，制成水煎剂，灭菌分装，4 ℃冰箱保存备用。养营活血汤按高剂量4.734 g/mL，每日2 mL/200 g 剂量灌胃1次，持续灌胃8周。鳖甲煎丸，杭州胡庆余堂有限公司生产，批号:180810;每日以540 mg/kg体重灌胃，持续灌胃8周;秋水仙碱粉，购于上海展云化工有限公司，用前用蒸馏水配制成悬浊液,每日以0.2 mg/kg体重灌胃，持续灌胃8周。

1.2.2 主要试剂：RIPA裂解液、DEPC水购置于北京索莱宝科技有限公司，ECL发光试剂盒购于中杉金桥公司，PVDF膜购于Millipore公司，X射线胶片购于Carestream公司。一抗：Vimentin、TGF-β1、α-SMA(均来自BIOSS兔多抗);氯仿、异丙醇、无水乙醇均购置于天津市永大化学试剂有限公司;HiFiScriptT 快速去除基因组cDNA第一条链合成试剂盒、UltraSYBR Mixture 荧光定量试剂盒为康为试剂。

1.2.3 主要仪器设备： 称量天平(Sartorius公司)，低温高速离心机，蛋白浓度定量仪，移液器，离心机，生物分光光度(Eppendorf公司)，超低温冰箱(SANYO公司)，超纯水仪(北京康铭泰克科技发展有限公司)，电泳仪(北京六一公司)，半干转膜仪系统(ATTO公司)，转移脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造有限公司)，分析仪器(Tanon 公司)，旋振荡仪(QL-902海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，荧光定量PCR仪(Biosystems)。

1.3 方法

1.3.1 建立肝纤维化大鼠模型及分组给药：将实验动物适应性饲养1周后，随机分为空白对照组、模型对照组、养营活血汤治疗组、秋水仙碱治疗组、鳖甲煎丸治疗组共5组，每组12只。除空白对照组外，其余4组均按经典的四氯化碳(CCl4)诱导肝纤维化大鼠模型造模方式，并辅以高脂肪、低蛋白饮食及乙醇饮料配合作为饮食控制条件，皮下给予 40% CCl4与石蜡油混合液注射，首剂注射量依照5 mL/kg体重标准计算，之后依照3 mL/kg体重计算，每4 d 注射1次；同时在注射CCl42 d后腹腔予猪血清注射，首次2 mL/kg，之后1 mL/kg，每4 d注射1次，造模6周。为排除昼夜节律的影响，每天定时给药，各组均持续给药6周。

1.3.2 肝组织样本采样：处死大鼠后摘取肝脏，取大鼠相同部位肝叶，制备肝组织样本。

1.3.3 蛋白指标检测：Western blot法检测肝组织样本。液氮下研磨，加入RIPA裂解液，4 ℃冰箱过夜，离心后取上清液，经测定蛋白浓度并进行对比后调成一个最终浓度，经煮沸、变性、上样、跑胶、转膜等步骤，洗膜后在4℃条件下分别放在 TGF-β1(1∶1 000配置)、Vimentin(1∶1 000配置)、α-SMA(1∶3 000配置)抗体配置液中(需过1夜)，洗膜后进行二抗工作液反应，根据条带的亮度适当选择曝光时间并条带扫描分析结果。所测目的蛋白TGF-β1、Vimentin、α-SMA表达水平以灰度比(目的条带灰度值/内参条带灰度值)表示。

1.3.4 实时荧光定量PCR(RT-PCR检测)：内参基因扩增用的引物表见表1。检测样本中目的基因mRNA转录水平的变化情况，采用2-△△CT法进行相对定量分析，扩增后进行溶解曲线分析。依据公式计算得到TGF-β1、Vimentin、α-SMA mRNA的相对含量,见表1。

表1 RT-PCR检测目的基因引物

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织中TGF-β1、Vimentin、α-SMA蛋白表达:养营活血汤组与其他组大鼠肝组织中TGF-β1、Vimentin、α-SMA 蛋白表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)，养营活血汤组与秋水仙碱组TGF-β1、Vimentin、α-SMA蛋白表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；养营活血汤组与模型对照组、鳖甲煎丸组α-SMA蛋白量比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2与图1(目录后)。

表2 各组大鼠血清TGF-β1、Vimentin、α-SMA蛋白的相对表达量比较

2.2 实时荧光定量PCR检测各组大鼠肝组织TGF-β1、Vimentin、α-SMAmRNA的相对表达量：养营活血汤组与其他各组大鼠肝组织中TGF-β1、Vimentin、α-SMA mRNA表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠肝组织中TGF-β1、Vimentin、α-SMAmRNA的相对表达量比较

3 讨论

抑制TGF-β1信号通路能有效阻止HSC的活化[1],TGF-β1信号通路可分为TGF-β1/SMAD信号通路和非经典的SMAD信号通路。TGF-β1/SMAD信号通路TGF-β1双聚体先与type Ⅱ型受体连系，type Ⅱ型受体招募并磷酸化type I型受体，磷酸化后的type I型受体吸引并磷酸化regulated SMAD卵白(R-SMAD)，这些卵白再与common SMAD(coSMAD)连系。R-SMAD与coSMAD形成异元二聚体，进入细胞核后作为多种ECM基因表达的转录因子，参与目标基因表达的调控[6]。非经典的SMAD信号通路是非SMAD信号分子通过磷酸化受体激活的SMADs连接区进行信号传导,包括MAPK、PI3K/ART、NF-kB信号通路，其中MAPK信号通路是研究最多的交叉通路[7],均参与EMT的过程。研究表明EMT参与肝纤维化过程并发挥重要作用，TGF-β1信号通路的激活，可激活Vimentin、α-SMA产生。Vimentin作为EMT间质表型蛋白表达上调，从而产生ECM沉积，促进肝纤维化的产生[8]。TGF-β1因子释放增多，活化 HSC，刺激成纤维样细胞的增殖，加强α-SMA的表达[9]。α-SMA是HSC活化的标志，HSC活化产生的TGF-β1是最重要的致纤维化因子[7]。

养营活血汤是由周波教授运用温病学理论，以营阴亏虚、血液瘀滞为基本病机，根据多年治疗肝纤维化的临床经验，制定出的中药组方，药物组成有当归、川芎、熟地、白芍、党参、丹参、陈皮、茯苓、鳖甲、柴胡、炙甘草、大枣共12味中药组成，本方具有益气养营、补血活血的作用。前期课题组经临床已经证实养营活血汤治疗肝纤维化临床有效率为92.5%[2]。研究表明养营活血汤可降低大鼠血清TNF-α和IFN-γ含量，可明显抑制NF-kB mRNA的表达，降低肝纤维化大鼠血清TGF-β1浓度及肝组织α-SMA的表达，直接或间接抑制了HSC的活化而改善肝组织的纤维化程度[3-5]。养营活血汤高剂量组可改善纤维组织增生[10]。秋水仙碱通过对TGF-β1的抑制，以达到抗纤维化的作用;鳖甲煎丸是临床治疗肝纤维化的推荐用药[11]。我们基于TGF-β信号通路，通过肝纤维化通路上相关指标的检测，进一步研究养营活血汤对TGF-β1、Vimentin、α-SMA的影响，探讨养营活血汤抗肝纤维化的作用机制。

转化生长因子β(TGF-β)是目前公认的纤维化疾病发展过程中起关键作用的细胞因子[12]，是迄今为止发现的最强的细胞外基质沉积促进剂，它可以对HSC进行活化，能够诱导成纤维细胞迁移，发生EMT，从而激活成纤细胞向肌成纤细胞的转化。在肝纤维化形成过程中，TGF-β信号通路可调控EMT的过程，是EMT中最主要的正向调控机制之一[13]，抑制EMT可抑制纤维化的转化。α-SMA是活化的成纤维细胞的标志，参与合成Ⅰ型胶原、Ⅲ 型胶原、纤维连接蛋白等多种细胞外基质成分，促进肝纤维化的发生，是评判肝纤维化活动性的标志物[14]。Vimentin是EMT发生的重要标志物，在EMT过程中Vimentin、α-SMA皆可升高。

肝纤维化的形成原因较多，病机复杂，治疗手段多样，是本虚标实之证。本虚主要以营阴亏虚为重要的因素，标实以血液瘀滞为关键，治疗则以扶正祛邪为基本原则，即补益营阴、活血化瘀是重要的治疗方法。养营活血汤是基于“肝藏血”和“肝体阴用阳”的理论，认为肝纤维化的基本病机为营虚血瘀，课题组在四物汤基础上演化而成，全方具有养营(养血)活血行气之功效。TGF-β信号通路和EMT在肝纤维化中是非常重要的，肝纤维化可导致肝硬化和肝癌。对于肝纤维化的西医治疗还没有特定的药物，中药复方靶向调控肝纤维化是目前的治疗热点。

通过观察该动物模型对照组TGF-β、Vimentin、α-SMAmRNA和蛋白水平明显上升，TGF-β信号通路和EMT同时产生，表明养营活血汤可降低TGF-β、Vimentin、α-SMA的mRNA的含量，降低TGF-β、Vimentin、α-SMA蛋白的表达水平从而起到抗肝纤维化的作用。故证明养营活血汤可能通过TGF-β信号通路和EMT靶点来治疗肝纤维化，TGF-β信号通路可调控EMT的过程，通过抑制EMT的过程，从而抗肝纤维化，肯定了肝纤维化营虚血瘀的病机内涵，丰富了肝纤维化的理论病机内涵，成为肝纤维化治疗理念的突破口。EMT对肝癌发生具有重要意义，也为治疗肝纤维化-肝硬化-肝癌提供了思路。