头腹针结合颈通康对颈动脉狭窄脑血流低灌注模型大鼠干预机制研究

周海纯，韩晓庆，宋志强，赵 娜，刘一潇，王东岩，邢学良△

(1.黑龙江中医药大学第二临床医学院,黑龙江 哈尔滨 150001;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040; 3.黑龙江省鸡西矿业集团总医院,黑龙江 鸡西 158199)

随着人口老龄化的到来及人们生活环境的改变,颈动脉狭窄(Carotidarterystenosis，CAS)成为一种临床常见疾病。通过流行病学调查显示，无临床症状的重度颈动脉狭窄在人群中有较高的发病率，已达到0 %～3.1 %，当男性年龄≥80岁时，患有中重度颈动脉狭窄者则达到10.6 %[1]。

颈动脉狭窄与低灌注脑血管疾病密切相关，当颈动脉狭窄到一定程度以后，会引起脑血流动力学的改变，即继发性的脑缺血表现——大脑低灌注，长期大脑血流灌注不足会出现一系列脑损伤的表现[2]。研究表明大脑低灌注损伤血脑屏障同时会激活免疫反应,对神经细胞和血管内皮功能产生影响。免疫反应会使胶质细胞被激活，而胶质细胞具有双向作用,既可以产生细胞毒性分子来损伤神经细胞亦可分泌神经生长因子保护神经[3]。神经血管单元是由脑微血管内皮细胞、神经元、胶质细胞以及血脑屏障组成[4]。保证神经血管单元结构的完整和健全并且令大脑进行正常的功能运动。调控神经血管单元可以达到改善大脑的低灌注状态。

颈动脉狭窄在中医无相关病名，现代中医学家认为动脉狭窄是由动脉硬化而来可归为“脉浊”。颈动脉狭窄引发的大脑低灌注状态，依据其临床表现在中医可归为“中风”“眩晕”“失眠”“痴呆”等病。

目前临床治疗该病从生物信息学角度考虑皆是对单一神经、血管和细胞等的影响来治疗相关症状。补阳还五汤能够保护神经血管单元的功能及结构的完整性，可以有效降低脑血流低灌注后神经元的凋亡，提高脑组织缺血后的功能恢复[5]。本研究所用颈通康是以补阳还五汤为基础方，结合多年临床治疗缺血性脑血管疾病患者的经验，总结出的经验方，临床应用多年，在改善颈动脉狭窄所致脑组织低灌注方面疗效显著。且于2019年、2020年就颈通康的方剂组成及相关配制方法成功申报发明专利2项。

本研究旨在探讨头腹针疗法结合颈通康干预颈动脉狭窄引发的大脑低灌注通过对神经血管单元的调节达到再灌注促进脑功能的恢复。希望为临床针药结合治疗颈动脉狭窄相关疾病提供实验基础和治疗新思路。

1 实验材料

1.1 实验动物来源

实验动物Wistar健康雄性大鼠50只，体质量为(180±20)g，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供[动物实验许可证编号:SCXK(黑)2019-001]。

1.2 主要仪器和试剂

电热三用水箱(北京医疗设备厂有限责任公司);湿盒(Boster Industrial corporation Limited);冲洗瓶(Boster Industrial corporation Limited);原位杂交专用盖玻片(Boster Industrial corporation Limited);光学显微镜(Olympus German)。

1.3 方剂制备

本实验所用中药制剂补阳还五汤及颈通康药材均购自黑龙江中医药大学附属第二医院哈南分院草药局并由其代煎。

2 研究方案

2.1 实验动物分组

将50只大鼠随机分为颈动脉狭窄组45只、假手术组5只；造模成功后颈动脉狭窄组随机分为针药治疗组、中药治疗组和模型组各15只。

2.2 模型制备

参照周振华等[6]提出的可控程度颈动脉狭窄模型制作方法即“针控线栓法”并对其加以改进。造模前用地塞米松浸泡手术缝线10 min。术前8～12 h大鼠禁食，可自由饮水。采用10 %水合氯醛腹腔注射的方式对大鼠进行麻醉，置于鼠架上仰卧固定，颈部正中去毛备皮，常规消毒后，行颈正中切口2～3 cm，认真分离皮肤和肌肉。在颈前肌肉与侧方肌肉之间钝性分离颈总动脉并游离，在颈总动脉近心端距颈内动脉与颈外动脉分叉约1.5 cm放置注射用针头0.9 mm(重度狭窄)，用0号手术缝线将颈总动脉和注射器针头扎紧并打成活结，留置线头，然后谨慎拔出针头，血流恢复后因线圈仍结扎，即造成一定程度的颈总动脉狭窄。缝合皮肤后对伤口进行常规消毒，肌内注射青霉素40万U进行预防感染。假手术组只分离颈总动脉，不结扎，余处理同模型组。术后大鼠即可自由活动，置于24～26 ℃环境下分笼喂养，每笼6～8只，自由饮食、进水。对假手术组大鼠正常饮食喂养6周，颈动脉狭窄组大鼠高脂饮食饲养6周后行水迷宫实验，神经功能及行为学功能检测。

2.3 实验动物筛选标准

2.3.1 纳入标准 ①神经功能Bederson5评分≤5分；②行为学检测<9分。

2.3.2 剔除标准 剔除由于麻醉、手术和饲养等原因死亡或术后存活时间未能达到取材时间要求的大鼠。

2.4 干预方法

2.4.1 假手术组 对造模成功后假手术组大鼠常规喂养6周后，与颈动脉狭窄组大鼠同时进行治疗，予以生理盐水混悬液2 mg/(kg·d)灌胃。

2.4.2 模型组 对造模成功后高脂饮食喂养6周行水迷宫实验、神经行为学功能检测，符合纳入标准后给予生理盐水混悬液2 mg/(kg·d)灌胃。

2.4.3 治疗组 对造模成功后符合纳入标准的大鼠随机分为中药治疗组和针药结合治疗组，予以中药治疗和针药治疗。

中药治疗组:颈通康比例为“20∶2∶1.5∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1”，取黄芪40 g，当归尾4 g，赤芍3 g，丹皮、地龙、川芎、琥珀、桃仁、红花、三七、红景天、水蛭、甲珠、葛根、天麻、鸡血藤、山楂各2 g。100 mg/(kg·d)灌胃。1次/d,共2周。

针药治疗组:针刺结合颈通康治疗。针刺治疗头穴丛刺：依据“大鼠穴位图谱”选取顶前区、顶区[7]；腹针选穴：依据孙氏腹针疗法[8]选取腹二区、腹四区和腹五区。操作方法：在鼠板上固定颈动脉狭窄模型大鼠，选取0.25 mm×15 mm一次性无菌针灸针(苏州医疗用品有限公司华佗牌针灸针，苏械标准20162270970)头穴丛刺沿皮平刺大约3 mm[7]；腹针以15 °～30 °斜刺入皮下2 mm，每次留针30 min[8]；针刺治疗1次/d，治疗6 d休息1 d，共治疗2周。中药治疗同中药治疗组。

2.5 脑组织取材

对各组大鼠分别于治疗后3 d、7 d及14 d每次选取5只进行取材。用EP管保留脑组织标本。

2.6 评价指标

2.6.1 神经功能评分 造模成功后24 h对存活的大鼠进行神经功能评分，采用Bederson等建立的5分评分法进行。评分标准见表1。

表1 Bederson5分评分法

2.6.2 行为学功能测验 行为学功能检测由网屏测验、平衡木测验及抓握-牵引测验组成。见表2。

表2 行为学评分标准

将实验大鼠在3项行为学测验的实际得分加和，测验分值范围0～9分。所得结果为该实验大鼠的测验分数。

2.6.3 原位杂交检测指标NCAMNCAM(神经细胞黏附分子) 主要表达于神经系统，是神经干细胞迁移的标记物。在神经细胞、神经元的生长、重塑和神经纤维的形成等过程中起重要作用。神经元和神经细胞是神经血管单元的重要部分。NCAM分化为相应的神经细胞后可修复大脑低灌注后损伤的脑组织，对神经血管单元起到一定的调控作用。本实验通过观察NCAM的表达变化判断针药结合对神经血管单元的影响。

2.6.4 免疫荧光标记及激光共聚焦 观测检测指标GFAP、NeuN及GFAP(胶质纤维酸性蛋白)在神经血管单元的星形细胞中有丰富的表达，是星形细胞的标志蛋白。在脑血流灌注不足出现缺血性损伤时,GFAP可吞噬细胞外的有害物质,以维持脑功能的稳定，还可以调控神经血管单元的恢复[9]。当颈总动脉闭塞时，GFAP的表达会增多。NeuN(神经元核抗原)是成熟神经元细胞核的特异标记物，当神经元受损后NeuN的表达会显著降低同时会引发神经元的死亡，其表达水平可直接评价神经细胞丢失、死亡以及量化治疗效应[9]。研究显示脑缺血时调控NeuN的表达可有效修复神经血管单元[10]。以神经血管单元为基础，应用NeuN和GFAP联合评价，能够更好地反应缺血脑组织的神经损伤程度。选择Dil染料预先标记SVZ细胞再分别采用GFAP抗体、NeuN抗体行免疫荧光标记，又选择了Brdu标记与特有的细胞表面标记相结合的方法。观测时激发波长为543 nm,通过激光共聚焦观察Dil+/Brdu+/GFAP+、Dil+/Brdu+/NeuN+细胞计数能够反映各种疗法调控神经血管单元的情况。

2.7 统计学处理

本实验研究采用SPSS25.0统计软件进行统计学分析。使用单因素组间方差分析(ANOVA)方法对实验结果进行统计分析。

3 结果

3.1 各组神经功能评分比较

在治疗前各组大鼠皆出现神经功能的异常,模型组、中药组和针药组3组之间神经功能评分无统计学意义(P>0.05)。中药组、针药组的大鼠在治疗第7天、第14天后神经功能均显著恢复,模型组大鼠亦出现一定程度的恢复,其原因可能为大鼠的神经自愈功能。治疗后第7天中药组与针药组疗效优于模型组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);针药组疗效优于中药组，差异有统计学意义(P<0.01)。治疗第14天中药组和针药组同模型组比较差异有统计学意义(P<0.01);针药组同中药组进行比较差异有统计学意义(P<0.05)。说明中药法及针药结合法治疗颈动脉狭窄脑血流低灌注模型大鼠第7天及第14天后可有效改善大鼠神经功能状态,但针药法优于单纯中药。见表3。

表3 各组神经功能比较

3.2 各组行为学功能测验

表4显示，在治疗前各组大鼠均表有行为学功能异常，各组行为学功能检测比较无统计学意义(P>0.05)。中药组及针药组大鼠在治疗7 d及14 d后行为学功能均有明显改善，模型组大鼠行为学也有改善，分析其原因或为大鼠具有自我修复功能。在治疗第7天、14天中药组、针药组同模型组进行比较差异有统计学意义(P<0.01)；针药组同中药组比较结果有统计学意义(P<0.01)。说明中药法及针药结合法治疗颈动脉狭窄脑血流低灌注模型大鼠第7天及第14天后可有效改善大鼠行为学功能，但针药法优于单纯中药。见表4。

表4 各组行为学功能比较

3.3 各组NCAM表达结果

实验结果显示，NCAM阳性细胞在每组的各检测时间点皆有表达，胞浆为棕黄色；在治疗过程中随着时间及脑血流灌注不足时间的延长NCAM的表达会逐渐增加，在治疗7 d时达到高峰，之后NCAM的表达开始下降。见图1。由表5可知，疗后3 d、7 d和14 d各治疗组同模型组进行统计学比较，差异有统计学意义(P<0.01)。说明各治疗方法均有效；针药组同中药组进行统计学比较，差异有统计学意义(P<0.01)，说明针药法对调控神经血管单元中NCAM的表达影响更大。

表5 各组大鼠在不同时间点NCAM阳性细胞表达计数

3.4 各组Dil+/Brdu+GFAP蛋白表达结果

实验结果显示随着治疗时间的延长GFAP的表达逐渐增多,在第7天时达到高峰,随后开始下降。见图2。在治疗后第3天及第7天和14天时中药组与模型组比较GFAP的表达差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);在治疗后第3天、7天和14天针药组同其他各组进行比较GFAP的表达经统计学分析比较差异有统计学意义(P<0.01)。提示针药组调控神经血管单元中GFAP的表达,星形胶质细胞的活性,神经血管单元结构及功能的作用优于中药组,模型组显示最弱。见表6、图2。

表6 各组大鼠在不同时间点GFAP阳性细胞表达计数

3.5 各组Dil+/Brdu+NeuN蛋白表达结果

Dil+/Brdu+NeuN细胞计数体现了各治疗方法对神经血管单元的调控作用，对脑血流低灌注的改善作用。实验结果显示：Dil+/Brdu+NeuN细胞计数在各治疗组各时间点均有表达，第7天阳性细胞表达到高峰，之后开始回落，胞核着红色荧光的为Brdu 阳性细胞,蓝色荧光为Dil阳性细胞。绿色荧光的为NeuN阳性细胞，淡橘黄色的为双标Dil+/Brdu+NeuN阳性细胞。见图3。依据统计学报告疗后3 d中药组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；在7 d、14 d各治疗组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。疗后3 d、7 d和14 d针药组与中药组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。说明在整个治疗过程中，各治疗方法均有效，其中针药法对阳性细胞影响最大。见表7。

表7 各组大鼠在不同时间点NeuN阳性细胞表达计数

4 讨论

长期颈动脉狭窄会导致大脑慢性血流灌注不足。长期慢性脑血流灌注不足会引发一系列脑损伤的表现如行为学功能异常、神经功能异常[11]。究其原因皆是对神经血管单元产生了影响而出现神经功能及行为学功能异常。慢性血流灌注障碍后及时有效修复神经血管单元，有利于维持整个单元稳态，为新生神经元提供营养支持，促进脑功能恢复[12]。

神经血管单元(NeurovascularUnit,NVU)的稳定有助于维持脑功能的完整性。神经血管单元的提出，为治疗神经系统、脑血管相关的疾病提供了一个新的研究方向及治疗思路。神经血管单元内的各个组织结构是相互影响的，基于此将各组织结构相联合考虑有利于详细分析脑组织灌注不足后的发展变化。神经血管单元的结构及功能的完整性对于改善脑损伤后的恢复发挥着至关重要的作用。通过调控神经血管单元可有效促进神经元及血管的新生及修复[13]。

补阳还五汤对于神经元的生长和修复有显著疗效[14]。神经血管单元在修复过程中，对血管新生起着重要作用。血管新生是指新生长的血管形成新的侧支循环，改善受损脑组织的血流供应，为受损脑组织提供营养，促进神经元的新生及修复，推动神经功能的恢复。补阳还五汤通过激发血管内皮因子的表达以促进受损血管的恢复及新生，促进脑损伤后的恢复[15]。同时对保护神经血管单元功能完整性、减少脑缺血导致的脑梗死面积和提高脑缺血后神经行为学的恢复有不可或缺的作用[5]。

本研究中针刺方法选用头腹针疗法。头腹针疗法是以中医脏腑经络理论、现代医学的脑肠轴理论以及神经定位理论为基础总结而成的针刺疗法。其中脑肠轴理论完美的将头与腹联合，周海纯等[16]的研究证明头腹针疗法可以促进脑损伤后大鼠神经干细胞的增殖分化，有效改善脑损伤后大鼠神经和行为功能。头为诸阳之会，十二正经中有胃、心、小肠、膀胱、三焦、肝与胆七条经脉皆循经头面，奇经八脉中有督脉，阳跷脉，阳维脉循经头面。人体气血精微通过十二经脉，奇经八脉，经筋别络上注于头，充养脑髓。脑髓得养，则身体强健。针刺头部腧穴可以激发一身之阳气。人体阳气充盈则经脉畅通，并且头穴丛刺疗法依据现代医学大脑全息与人体相对应同时在针刺过程中形成一种“场”，对脑部疾病进行调控。十二正经“内属于脏腑，外络于肢节”和奇经八脉、经筋别络皆与脏腑相关。手太阴经起于中焦，中焦属脾胃；手阳明经下膈属大肠；足阳明经属胃络脾且其有支者起于胃口，下循腹里；足太阴经属脾络胃，其有支者走行胃里；手少阴经络小肠；手太阳经有支者过胃，属小肠；足太阳经络肾属膀胱，膀胱位于腹部；足少阴经属肾络膀胱；手厥阴经，历络三焦；手少阳经属三焦；足少阳经与足厥阴经循行过胸腹；十二经脉循环无端皆与腹部相连；任、督、冲一源三岐皆起于胞宫，与腹部相连，且3条经脉循行皆过腹部。基于此，在腹部针刺可通调十二经络气血和五脏六腑。因此将头腹针联合可达到从肠调脑，以脑调肠形成良性循环。

同时有研究证明[17]当肠道菌群和脑肠肽发生改变时会激活机体的免疫反应，对神经、血管功能产生影响。基于此可通过对脑肠轴的调节可实现调节神经血管单元的目的。

本实验研究应用的中药制剂是以补阳还五汤为基础方，经临床经验总结而成的颈通康，主要组成为黄芪40 g,当归尾4 g,赤芍3 g,川芎、桃仁、红花、地龙、三七、红景天、水蛭、甲珠、丹皮、葛根、天麻、琥珀、鸡血藤与山楂各2 g；方中重用黄芪以补气，气旺则血行，以促进血液运行；当归活血通络，赤芍、川芎、桃仁、红花、三七与红景天可增加脑供血；水蛭、地龙可抗凝；甲珠、丹皮、葛根、天麻、琥珀、鸡血藤及山楂合用可通经活络、化痰祛瘀，改善瘀滞。

此研究结果显示，头腹针疗法结合颈通康治疗第7天、14天，神经功能评分、行为学评估均优于模型组和单纯中药组。由此可推断头腹针疗法结合颈通康能够促进颈动脉狭窄引发的脑血流低灌注模型大鼠神经功能及行为学功能的恢复，可有效改善脑功能。同时NCAM、GFAP和NeuN的阳性表达均在7 d达到高峰，在3 d、7 d和14 d时针药组与模型组和中药组比较差异有统计学意义(P<0.01)。说明头腹针疗法结合颈通康能够保护神经血管单元功能完整性，调节NCAM、GFAP和NeuN蛋白的表达。NCAM、GFAP和NeuN均具有双向调节作用，缺血早期神经元凋亡，为促进神经元的修复及新生，NCAM的表达和GFAP、NeuN的表达逐渐升高，随着缺血时间的逐渐延长NCAM、GFAP和NeuN的表达达到高峰后开始下降。NCAM、GFAP和NeuN均可以促进胶质细胞的活性，修复神经元，促进神经血管单元的完整性及稳定性。

本研究证明头腹针疗法结合颈通康可有效调节颈动脉狭窄脑血流低灌注模型大鼠NCAM、GFAP和NeuN的表达，修复神经血管单元，促进神经功能及行为学功能的恢复。能有效改善颈动脉狭窄低灌注状态下神经血管单元的结构及功能的稳定性，从而改善颈动脉狭窄低灌注，改善脑功能,为临床提供进一步实验依据,为脑缺血疾病的治疗提供新思路。