植物体内金属纳米颗粒的表征技术与毒性效应

杜实之

（湖南农业大学 资源环境学院，长沙 410128）

纳米材料是指在三维空间中至少有一个维度处在纳米尺度范围（1～100 nm）或由它们作为基本单元构成的材料.纳米材料因为其小尺寸效应、量子尺寸效应、表面效应、宏观量子隧道效应等，而表现出独特的光、电、热、磁、催化以及生物活性等特殊功能［1］，多用于催化、聚合物的制备以及疾病的诊断和治疗等.金属纳米颗粒的广泛应用，也给陆地和水生生态系统带来安全风险，若水果和谷物中检测到金属纳米颗粒，它们可能转移到食物链并对人类健康构成威胁［2］.

金属纳米颗粒的表征对于获得有关其性质及其应用的信息至关重要，表征技术的选择应考虑基质的复杂性、分析物浓度和物理化学特性.目前可以运用多种手段对金属纳米颗粒进行分析与检测（粒径、浓度、形态等），主要的表征手段有显微镜及相关技术、色谱分析分离方法、质谱法等.

经过处理的金属纳米颗粒可用于改善农作物生长，如 Au NPs 可作为生长促进剂［3］；但 Ag NPs 等会对植物的生长会产生负面影响，如破坏蛋白质、减弱植物生长力和色素［4］；同时金属纳米颗粒还可能通过推动食物链逐级向植物营养链的高位富集，直接导致食物链中高级生物的毒性效应［5］.

本文基于近几年金属纳米颗粒对于植物的作用机制的研究结果，系统总结了纳米颗粒的分析测试和表征手段，探讨了纳米颗粒在植物内的吸收、迁移、累积和毒性效应，分析了纳米颗粒在环境中的安全性及其在环境中的归宿，为今后的纳米颗粒对植物的生态毒理效应研究等提供参考.

1 金属纳米颗粒的分析测试与表征手段

由于金属纳米颗粒的特殊性，表征检测相对复杂，首先要考虑其浓度和物理化学性质，目前常用的包括显微镜表征技术、电感耦合等离子质谱相关方法以及分离技术的联用.

1.1 显微镜及相关表征技术

显微镜通常用于评估纳米颗粒的大小、形状和颗粒聚集程度，透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）是目前最常用的单一颗粒的测量方法.TEM 图像可用于判断系统中是否实现了良好的分散或是否存在团聚，也能够直接观察液相中金属纳米颗粒的生长［6］，但用TEM 来处理样品需要消耗一定的时间并且工序复杂，因为它需要超薄的TEM载体；为了使金属纳米粒子便于后续处理，常常需要使用负染色材料（如磷酸或衍生物、醋酸尿素等）进行纳米粒子的固定；如若实验材料不足也可以将样品嵌入冰层中然后在液氮下暴露一定时长［7］.SEM对物质进行微观表征需要先利用高能电子束扫描样品，再通过光束与物质间的相互作用，激发出样品的物理性质，对这些信息收集、放大、再成像［8］.KASHIN［9］等通过 SEM 观察获得了 Pt/Pd合金纳米颗粒（5～100 nm）物体的形态，并描述了纳米物体的形态和尺寸与支撑表面性质、金属和溅射条件的关系.原子力显微镜（AFM）也被用来研究纳米颗粒形貌和结构在平面上的分布，它的优点是不需要特定的处理，无需繁琐且可能污染样品的步骤，只需要制备少量的样品，就能观测到聚合纳米的微观结构［10］.

在实际应用中，往往将电镜与能谱（EDS）联用，在对材料进行成像的同时也进行元素分析.但这两种电子显微镜检测样品除必须在真空条件下外，还需要花费较多的时间和经济成本对样品进行前处理，且不能对整个样品进行检测，具有片面性.而荧光显微镜通过对比染色的部位使表征更加清晰，常与其他表征方式联用.LEE 等［11］使用透射电子显微镜（TEM）用于观察银纳米颗粒的大小和形貌，通过能量色散光谱（EDS）对样品进行化学分析，证明了Ag NPs 被绿豆细胞吸收并且积累（图 1（a）、（b））.BALA 等［12］等处理水稻叶片后，发现 ZnO NPs 在气孔开口附近和硅细胞之间以单个颗粒和小团聚体的形式出现，SEM 和EDS 光谱检测到的强信号证明了ZnO NPs 通过水稻叶表面气孔进入植物系统.电镜需要精细的样品制备，速度慢，检查的颗粒少，但是它可以结合多种衍射处理衍射方法，使其成为表征金属纳米颗粒非常有价值的辅助手段［13］.

图1 植物样品中金属纳米颗粒的表征图Fig.1 Characterization of metal nanoparticles in plant samples

1.2 电感耦合等离子质谱相关方法

金属纳米材料的新兴表征法主要是单颗粒-电感耦合等离子质谱法（SP-ICP-MS），其原理是通过稀释、震荡等手段使纳米颗粒悬浮液达到足够低的浓度，使一次只有一个纳米颗粒进入ICP-MS 系统，并且控制流速；当粒子进入等离子体，被蒸发、雾化、电离后产生的离子通过ICP 导向质量分析仪，质量分析仪根据它们的质荷比来确定元素浓度进而得到产生瞬间信号的脉冲峰，其强度随着单个纳米颗粒中所含的原子数增加而增加［14］.

与传统的ICP-MS 模式相比，SP-ICP-MS 由于其高灵敏度、易用性和分析速度快等特点，目前成为一种理想的测定环境中纳米颗粒的技术，它不仅可以测量颗粒的多元素组成，还可以推导颗粒物的直径［15］.由于质量选择性检测器的灵敏度和快速采集速度，通过SP-ICP-MS 分析的颗粒样品必须稀释到足够低的浓度，确保单位时间只有单个颗粒物进入系统，而不是多个粒子的重叠.SP-ICP-MS 质谱仪检测到的单颗粒物事件所产生的脉冲强度信号与金属纳米颗粒物的质量大小/粒径大小成正比［16］.WEI等［17］使用 SP-ICP-MS 对芥菜和莴苣中的 Au NPs 进行表征，并证实了金纳米颗粒可以吸附在植物根的表面（图 2（a））.DAN 等［18］运用 SP-ICP-MS 从番茄植物中提取了Au NPs 但未引起Au NPs 的溶解或聚集，并准确测量出植物基质中Au NPs 的大小、尺度分布和颗粒浓度；此法可以用于检测植物组织的整体，而不是仅仅检测植物的一小部分，因此可以产生更准确的结果.

图2 芥菜、莴苣［17］和番茄［18］通过SP-ICP-MS检测到的金纳米颗粒Fig.2 Au NPs detected by SP-ICP-MS in mustard ，lettuce［17］and tomato［18］

1.3 分离技术的联用

环境中样品金属纳米颗粒的低浓度为各种检测带来了困难，因此需要采用一些有效的萃取和富集分离方法，在测试同时将纳米颗粒从环境中分离，提高检测准确度.流体动力色谱（HDC）是色谱分离技术中的一种，可用于有效分离环境中纳米颗粒，GRAY 等［19］用 HDC 方法分离了河水基中聚苯乙烯、银和金纳米颗粒的复杂混合物，解决了金属纳米颗粒从其复杂的环境矩阵中分离的难题.场流分离系统（field-flow fractionation，FFF）是一套高分辨率的洗脱技术，非常适用于分离样品尺寸在1 nm～1 μm 的大分子、胶体及纳米颗粒.与其他技术相比，FFF 技术不受降解、过滤、分离度或不必要的吸附的限制，降低了每个分析设备的样品多分散性和复杂性，理想情况下还增加了颗粒的大小［20］.SOMCHUE等［21］表明：分离主要基于电泳迁移速率，运用场流分离系统可以表征具有不同粒径的金属纳米颗粒.不对称流场流分馏（AF4）可以表征具有不同程度的多分散性的Ag NPs 产物，并且具有更快速和更直接等优点［22］.

2 金属纳米颗粒在植物中的积累

纳米颗粒对植物的生态毒理效应研究尚处于探索阶段，总的来看纳米颗粒对于植物个体的作用体现在植物体内的积累，从而影响植物的生长和代谢，但是纳米颗粒在植物体内的积累受到许多环境因素和纳米颗粒特性的影响.

2.1 纳米颗粒在植物内累积的影响因素

与重金属等其他污染物不同的是，金属纳米颗粒的粒径对其性质有着很大的影响.对于同等条件下的植物暴露处理时，按照从根部进入的条件来看，粒径较大的金属纳米颗粒进入植物体内的数量会偏少，如 FALCO 等［23］研究表明 Ag NPs 诱导的蚕豆叶片中PSII光化学效率、气孔导度随着Ag NPs 直径的减小而增加，这是由于较小纳米颗粒的总表面积较大，在固定浓度下对细胞更具毒性和反应性而引起的，研究证明了纳米颗粒的浓度和其在植物体内的累积量成正比，但具体的关系没有被发现.植物物种之间的一些物理化学变化，如导水率的差异、细胞壁的孔径等，可能会影响纳米粒子的运输和积累［24］.除了纳米颗粒本身性质的影响之外，环境因素对纳米颗粒在植物中的积累也有影响，比如环境的pH 值、基质的有机质含量甚至是土壤中各种根系微生物等都对其有很大的影响［25］.

2.2 金属纳米颗粒进入植物的途径

对于金属纳米颗粒进入植物体内的途径有两种主要的看法（图3）.一部分学者认为，金属纳米颗粒主要从土壤或者水体中进入植物，通过根系组织进入植物体内，从根部向茎和叶迁移，最终可能影响到果实和种子等部位（图3（a））［26］；另外一部分学者认为纳米颗粒从叶面的气孔等直接进入植物体内，由于植物叶片的气孔较大，约为1 μm，因此纳米颗粒从气孔进入，由从上至下的方向，向茎和根的方向迁移（图3（b））［27］.

图3 纳米颗粒从植物根部［26］和叶部［27］暴露的示意图Fig.3 Schematic diagram of nanoparticles exposed from roots［26］and leaves［27］of plants

也有研究者们对这两种路径进行探究，对比分析了大豆和大米对于金属纳米颗粒不同暴露方式的毒性效应［28］，结果表明：同等条件下，从叶片进入植物体内累积的银纳米颗粒较多，这也为纳米颗粒主要为从上至下的迁移方式提供了依据.

3 金属纳米颗粒对植物的毒性效应

3.1 植物生长等宏观效应

纳米颗粒对植物的毒性效应，与环境条件密切相关，如植物生长期（种子、幼苗、成熟期）、纳米颗粒的浓度、粒径尺寸、处理时间均对其毒性效应有很大的影响，总的来说，较高浓度纳米颗粒会对植物生长发育产生抑制作用，常见的Ag NPs、Al2O3等在高浓度下均会减少植物生物量和植株生长高度.如 SIDDIQI 等［29］发现 Ag NPs 减少了可食用植物（葱、卷心菜和生菜）等蔬菜的质量，主要是因为Ag NPs 作为乙烯抑制剂并激活植物中的抗氧化剂.而对于幼苗的生长，大多数都是植物生长高度受到一定的抑制，根系发育也受到了同步的影响.如BURKLEW 等［30］表明：当 Al2O3纳米颗粒的浓度从0.1%上升至1%时，每株烟草幼苗根的长度、植树平均高度和叶片数量均有所下降.

但是，低浓度的纳米颗粒并不会给植物带来任何不利影响，甚至在特殊情况下对植物生长有促进作用，如 ALAGHEMAND 等［31］运用纳米氧化锌喷施黑孜然，相比于对照组，在采用0.2%的锌纳米颗粒喷雾处理的情况下，黑孜然的植株高度从25 cm 增长至75 cm；BEHBOUDI 等［32］发现在干旱情况下，施用90 mg‧L-1的SiO2纳米颗粒使旱地植物的叶绿度和相对含水量分别提高了约12%和84%.

SIDDIQI［33］表明：导致两种不同现象的原因是在较高的浓度下，金属纳米颗粒会产生压力或毒性并增加植物体内活性氧的产量，使细胞代谢遭到破坏，最终导致植物根的伸长受到抑制和产量明显下降；而在较低浓度下，金属纳米颗粒可以增加生长素（IAA）和光和色素的含量，对植物生长起到促进作用.

3.2 光合作用的影响等微观效应

许多研究也开始探讨金属纳米颗粒对于植物光合作用的影响.NPs 通过作用于Rubisco 酶来影响光合作用，FARAZ 等［34］研究的大多数金属纳米颗粒都可以增强或抑制Rubisco 酶的活性和光合速率.某些纳米颗粒对植物光合结构有不利的影响，尤其是CuO NPs 对其活性有明显的抑制效应，并随着浓度的增加其抑制效应越显著，导致光合色素减少，叶绿体中的基粒被破坏或者严重畸形［35］.然而，TiO2NPs可以提高某些作物（如蚕豆）对低温胁迫的耐受性，通过激活叶绿体中的光化学反应，增加光合作用运输链中的能量［36］.表1 列举了一些金属纳米颗粒对植物光合作用的影响效果，发现其对植物光合作用的影响为有利或有害，它具有改变植物光和效率的能力，KATARIA［37］等表明这可能与金属纳米颗粒对光的敏感程度有关.

表1 金属纳米颗粒毒性效应的案例Tab.1 Examples of toxic effects of metal nanoparticles

3.3 金属纳米颗粒对植物毒性效应作用机制

与其他大中小颗粒生物材料应用相比，NPs 颗粒可以直接或者透过植物细胞壁和植物细胞膜孔径进入许多植物细胞内部，改变植物细胞膜透性，破坏植物细胞膜的完整性，与植物细胞内其他细胞器（内质网、液泡和细胞吞噬体）相互作用，随后可能导致细胞和植物遗传激素水平的严重毒性［52］.金属纳米颗粒对植物的毒性作用主要表现在生理水平（如抑制根的生长和延缓植物发育等）以及细胞水平（如叶绿素合成中断和细胞膜的损伤等）.

NPs 本身具有较强的表面活性，在吸收能量或接触生物体内的电子供体时会导致细胞内ROS 的产生［53］.金属离子对细胞生化过程和电子传递链的干扰通常也会导致 ROS 的产生［54］.当ROS的水平值超过正常的阈值，其在细胞壁和质膜中的积累会导致植物叶片的凋亡和细胞死亡，并通过产生脂质衍生基加剧氧化应激，自由基的形成会破坏叶绿素合成、脂质过氧化、蛋白质变性或染色体畸变，还有研究表明ROS 会降低有丝分裂的指数，从而损伤细胞［55］（图4（a））.而在高水平的氧化应激下，抗氧化防御系统超载且效率较低.根据MIRZAJANI等［56］将水稻暴露于Ag NPs 下，RNA/DNA 转录蛋白及细胞壁均有不同程度的损伤，最终导致了细胞的凋亡；HOSSAIN 等［57］用 Al2O3、ZnO、Ag NPs 来评估大豆幼苗的蛋白质水平，发现参与氧化还原、生长发育的蛋白质均发生了显著的变化.金属纳米颗粒对植物的毒性作用水平还取决于许多因素，如纳米颗粒物的浓度、大小、理化性质、植物种类、植物寿命等［58］（图4（b））.如前文所述，相对较低的浓度（100 mg·L-1）的NPs 对植物的生长有积极作用，而较高浓度往往会产生相反的效果.

图4 金属纳米颗粒对植物毒性效应及其影响因素［58］Fig.4 Toxic effects of metal nanoparticles on plants and influence factors［58］

从代谢成分变化来看纳米颗粒对于植物的毒害效应，主要是金属纳米颗粒和微生物细胞之间的静电吸引力破坏植物代谢活动.ZHANG等［59］从CeO2纳米颗粒处理的菠菜叶片的代谢产物中发现：抗氧化应激防御系统受到了影响，即酚类物质含量增加，引起菠菜根中氮代谢途径紊乱，影响氨基酸的合成，使其含量降低.而许多表型参数（叶绿素荧光、光合色素含量、植物生物量、脂质过氧化、膜透性）不受影响.然而，代谢组学分析显示：不同剂量的CeO2NPs 以非剂量依赖的方式诱导叶片和根的代谢通路的变化，低剂量比高剂量更能诱导菠菜叶片的代谢通路的变化.当NPs的组成、浓度、大小、形态和表面涂层发生变化时，NPs 的结果也会发生变化.因此，金属氧化物NP 的植物毒性机制，如ZnO NPs和Ag NPs，可能来自NPs的物理化学特性［60］.

4 结论与展望

纳米技术是一门进化科学，在电子、能源、医学和生命科学领域有许多新的应用.由于金属纳米颗粒独特的性质，其对植物的毒理学效应引起广泛重视.许多研究人员认为，金属纳米颗粒对植物生长和发育的影响决于纳米材料的性质、应用方式及植物种类.

从已有的研究来看，表征金属纳米的方法主要为显微镜表征技术、电感耦合等离子质谱法.显微镜表征技术操作简单，是目前最常用的单一颗粒测量方法；电感耦合等离子质谱法灵敏度高，测量结果准确，但若想要获得与金属纳米颗粒相关的各种特性，比如当前最主要的困难——纳米尺寸的表征，通常需要多种技术的结合；目前纳米颗粒的表征技术仍需要进一步提高准确性和分辨率，同时发展无损检测和原位表征技术等.

金属纳米进入植物的方法有两种，粒径较小的金属纳米颗粒容易进入植物体内，但环境对其影响也不可忽视.金属纳米颗粒对植物的生态毒理效应研究还处于起步阶段，总体来说，过量的金属和金属氧化物纳米颗粒对植物有害，而微量存在时对植物有益，但各种金属纳米颗粒的作用机制和毒性效应尚未被普遍认可，应该更加关注纳米颗粒在植物中的存在形式，考虑在更加复杂的作用体系下，它们是否会与其他污染物产生协同或者拮抗作用.除对水培植物样品的试验和监测，金属纳米颗粒在植物中如何迁移以及是否影响遗传也是其重要内容，还需要更多的研究来探索它们与生物分子的相互作用及其对植物基因表达调控的影响.