基于SNP 标记的黄河鲤鉴定研究

王彦云，王济世，刘晓夏，赵璐瑶，杨曙明

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081）

中国有4 000 多年的养鲤历史，是鲤生产与消费大国。目前，我国养殖的鲤品种主要为“3 大系列1 个品系6 个新品种”，分别为德国镜鲤选育系、荷包红鲤抗寒品系、豫选黄河鲤新品系，豫选黄河鲤、松浦镜鲤、松荷鲤和福瑞鲤，六个品种占了我国鲤主产区80%的鲤养殖品种。黄河鲤是目前市场上主要的鲤养殖品种之一，主要是黄河流域省份养殖和食用。黄河鲤价格高，具有较高的经济价值，受经济利益驱使，部分养殖者引进其他鲤假冒黄河鲤，以谋求较高的经济回报。这种做法，既侵犯了消费者合法权益、损害了黄河鲤的名声，也使得相关产业经营受损，黄河鲤从业者的生产积极性严重受挫，黄河鲤真实性问题亟待解决。

当下，主要基于传统形态学方法鉴别鲤。由于鲤生物多样性下降、鲤品质降低、种质退化和鱼肉加工升级等的影响，依靠传统形态学方法鉴定黄河鲤品种存在诸多困难，给养殖者和消费者造成极大的困扰[1-7]，利用SNP 标记技术则可克服以上缺点。

SNP（Single Ncleotide Polymorphism）又名单核苷酸多态性，是基因组水平上单个碱基的变异所引起的DNA 序列的多态性，属于第三代遗传标记技术。由于SNP 标记具有存在广泛、富有代表性、遗传稳定性以及易实现分析的自动化等特点，被广泛应用于种质鉴定、产品溯源等[8-16]。

1 材料与方法

1.1 DNA 样品的准备

实验样品共6 个品种320 个样品，包括黄河鲤（Cyprinus carpio）（n=70）、荷包红鲤（Cyprinus carpio Red var wuyuanensis）（n=50）、福瑞鲤（福瑞鲤2 号，n=50）、松浦镜鲤（Cyprinus carpio songpu mirror carp）（n=50）、建鲤（Cyprinus carpio var）（n=50）和丰鲤（Cyprinus carpio）（n=50）。这6 个品种包含了黄河鲤主产区常见鲤品种。黄河鲤样品包括豫选黄河鲤和野生黄河鲤，其中河南省水产研究院豫选黄河鲤原种36 尾，农业部黄河郑州段野生黄河鲤34 尾；荷包红鲤样品采自国家级婺源荷包红鲤良种场；福瑞鲤为最新福瑞鲤二号品种，采自国家新品种福瑞鲤河北繁育基地（唐山市丰南区丰越泥鳅养殖有限公司）；松浦镜鲤、建鲤和丰鲤样品采自养殖户。所有样品均使用国标方法进行了鉴定[17-20]，所有样品品种无误。引物由上海翼和应用生物技术有限公司合成。

验证样本从辽宁、山东、河南、四川等鲤养殖大省收集，共有40 个不同鲤样本。以黄河鲤之名销售的样本20，包括郑州鲤（n=5）、泰安鲤（n=5）、北京鲤（n=5），河北鲤（n=5）。其他鲤样本20 个。

利用GeneJET Genomic DNA 纯化试剂盒（Thermo Scientific,#k0721）提取采集的鱼肉组织基因组DNA。提取后的样品，首先用NanoDrop 2 000 c 分光光度计（Thermo Scientific,USA）检测，考察其浓度及纯度。然后用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，电压120 V，30～40 min，电泳结束后凝胶成像系统观察提取片段的完整性。符合标准的样品于-20℃储存备用。

1.2 SNP 的挑选

本研究采用两种方法挑选SNP，一是基于Carpbase 数据库（中国水产科学研究院生物技术研究中心），对已有SNP 标记进行挑选，群体验证后选择位点；二是基于数量性状基因，从已报道的与鲤体色、生长性状相关的基因上搜索位点。

1.2.1 基于数据库的挑选

通过Carpbase 数据库检索，依据以下三个标准挑选位点：（1）从鲤50 条染色体中挑选，根据每条染色体长度挑选1～4 个位点，且位点间距离大于8 Mb；（2）所选位点位于染色体非编码区；（3）最小等位基因频率（MAF）大于30%。共获得候选位点54个。针对挑选的54 个位点设计多重引物，利用多重PCR 反应扩增模板，产物纯化后利用二代测序平台（Illumina X-10 高通量基因分型平台）进行测定。二代测序由上海翼和应用生物技术有限公司提供技术支持（http://www.biowing.com.cn/）。用于数据库位点验证的鲤样本共计6 个品种、170 个样本，包括黄河鲤（n=70）、荷包红鲤（n=20）、福瑞鲤（n=20）、松浦镜鲤（n=20）、建鲤（n=20）和丰鲤（n=20）。54 个位点多重测序引物见表1。PCR 扩增体系共12 μL，其中：ddH2O 2 μL，Mix 6 μL，1 μM Primer 2 μL，DNA Sample 1.8 μL，ROS 0.24 μL。PCR 扩增反应条件：95℃160 min，然后94℃30 sec，60℃30 sec，72℃30 sec，共35 个循环，最后4℃∞。

表1 54 个SNP 位点测序引物Tab.1 Primer information of the 54 SNP markers

多重PCR 产物纯化后，使用Agilent 2100 对产物进行质控。

1.2.2 基于性状基因的挑选

通过NCBI 和Carpbase 数据库检索及文献报道，选择了与鲤体色、生长性状、肉质性状相关的53个基因[21-23]（表2）。上述53 个性状基因，每个基因选取1～5 个基因片段，考察各基因片段同源性，去除高同源，最终得到111 个可用待测片段。目标区域重测序结合多重PCR 技术和高通量测序技术，对待测片段设计多重PCR 引物。PCR 扩增体系和扩增程序同1.2.1。用于测序的样本共计130 个，包括黄河鲤（n=30）、荷包红鲤（n=20）、福瑞鲤（n=20）、镜鲤（n=20）、建鲤（n=20）和丰鲤（n=20）。高通量测序由上海翼和应用生物技术有限公司提供技术支持。测序结果通过SepMAN 软件比对多样本相同扩增序列，获得目标样本候选多态性位点，图1 为某个多态性位点高通量测序散点图。由图1 可知，该位点在鲤测试群体中基本不发生突变，主要以“T”的纯合子形式存在。

图1 高通量测序结果Fig.1 High-throughput sequencing results

表2 性状基因所在染色体及其他相关信息Tab.2 Chromosome location of trait genes and other relevant information

1.3 统计分析

通过直接计数方式获得各位点在样品群体中的等位基因频率、基因型频率[24]。根据公式计算耦合概率（matching probability,MP）[25]。

式中，m-位点数；n-位点k 等位基因数；Pki(j)-位点k 等位基因i、j 等位基因频率。

2 结果与讨论

2.1 位点筛选结果

通过两种方式获得的多态性位点，还需进一步挑选以满足黄河鲤鉴定的需要。挑选标准如下：（1）位点在黄河鲤（或普通鲤）中多态性较高，兼具两种纯合子和一种杂合子，位点在普通鲤（或黄河鲤）中多态性低，只具有一种纯合子；（2）位点在多态性较高的鲤品种中MAF 大于0.3，在多态性较低的品种中MAF 小于0.05。

按照以上挑选标准，共得到候选位点27 个。27个位点所在染色体及基因等信息见表3，位点在各鲤群体中的等位基因频率见表4。

表3 27个SNP 位点所在染色体位置信息Tab.3 Chromosomal location information of 27 SNP sites

2.2 黄河鲤的鉴定效果评估

27 个位点对黄河鲤与不同品种普通鲤的区分能力存在差异（表4）。为提高标记组特异性,提高鉴别效率，按照区分能力对位点进行排序，选择区分能力较好的12 个标记，用于黄河鲤与普通鲤品种的鉴别（表5）。黄河鲤被错误鉴定为普通鲤的概率用MP 值表示（图2）。

表4 27 个SNP 标记在各品种中等位基因频率Tab.4 The allele frequencie of 27 SNPs in each variety

由表5 和图2 可知，只需1～3 个标记就可实现黄河鲤与其中一个普通鲤品种的鉴别，而丰鲤与黄河鲤的鉴别只需1 个特异性标记即可。使用12 个SNP 位点组合，黄河鲤与各品种普通鲤鉴别效果较好，MP 值均小于6×10-5。其中，黄河鲤与松浦镜鲤、丰产鲤的鉴别效果最好，MP 值均接近于0；黄河鲤与荷包红鲤、福瑞鲤、建鲤的鉴别效果较好，MP 值在1×10-5～6×10-4之间。12 个SNP 位点组合特异性较高，理论上可以满足黄河鲤在80%鲤主产区的鉴别要求。进一步利用二代测序技术对40 个验证样本12 个SNP 位点进行分型，依据分型结果对样本进行鉴别（表6）。

表5 12 个SNP 标记位点信息Tab.5 Information of the twelve SNP loci

表6 40 个样本鉴别结果Tab.6 Identification results of 40 samples

图2 黄河鲤与普通鲤MP 值Fig.2 MP values of Yellow River carp and common carp

由表6 可知，郑州鲤全部鉴别为黄河鲤；泰安鲤、北京鲤以及河北鲤有少部分样本并非黄河鲤，而是福瑞鲤和建鲤；其他鲤样本仅有一个为黄河鲤，其余样本均为福瑞鲤。值得注意的是，40 个验证样本有一半为福瑞鲤，黄河鲤销售市场存在大量福瑞鲤的主要原因有以下两点：（1）福瑞鲤为野生黄河鲤和建鲤杂交选育的新品种，具有黄河鲤部分优良性状，与黄河鲤极为相似，深受养殖户和消费者的喜爱；（2）福瑞鲤为我国鲤主产区六大鲤养殖品种之一，具有养殖范围广、产量大的特点。

3 结论

本研究通过数据库挑选和性状基因搜索，共得到27 个SNP 候选位点。理论上只需12 个标记位点组合，就可满足黄河鲤在我国80%以上鲤主产区的鉴定，黄河鲤鉴定错误率小于6×10-5。利用标记组合对40 个验证样本进行鉴定，以黄河鲤之名销售的20 个样本，只有郑州鲤全部为黄河鲤，其他20个鲤样本多为福瑞鲤。在实际应用中，还可根据所处省份的不同，按照当地具体情况对位点进行选择，这样可大幅降低标记的数量，提高鉴别效率。在应用方面，可以考虑将等位特异性PCR 分型与毛细管电泳结合[26]，实现SNP 位点快速分型，这有助于在中小企业应用推广黄河鲤SNP 溯源，有利于黄河鲤的市场销售，保障消费者的合法权益[27]。