奶牛乳房炎主要病原菌EF-Tu 蛋白同源性及T、B 细胞抗原表位分析

范钊玮，陈晶，杨思宇，刘慧婷，王蓝悦，王然，马骏，王欣，冯振月，于永忠，崔玉东

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

奶牛乳腺炎是一种由细菌感染引起的急性或慢性乳腺疾病，临床表现为乳房肿胀、疼痛，发热、厌食、休克等，严重危害动物健康[1]。同时造成牛奶产量减少、牛奶成分改变和质量下降，给全世界奶业带来巨大影响[2]。引起奶牛乳腺炎的病原种类很多，但以无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）、乳房链球菌（Streptococcus uberis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli）[3-4]为主。其中，链球菌引起的奶牛乳腺感染占比最高，有时仅S.agalactiae 感染就占到38.61%[5]。过去人们对奶牛乳腺炎主要使用抗生素类药物进行治疗和防控，但随着抗生素的广泛持久使用，耐药菌株大量出现，导致临床上使用抗生素治疗的效果越来越差。因此，针对这些病原菌感染开发安全、有效的疫苗进行免疫预防显得尤为重要[6-8]。亚单位疫苗具有能够避免许多无关抗原诱导产生抗体、减少疫苗副反应和以及诱导良好的体液和细胞免疫应答等优点，并且蛋白质抗原保守性较好，已成为许多预防病原菌感染疫苗的研究对象。但引起奶牛乳腺炎的病原菌种类如此之多，使用多种病原菌的多个抗原作为疫苗在研制和应用中存在诸多困难。那么，能否寻找和选择这些病原菌中具有高度保守性的共同蛋白质分子作为疫苗候选抗原是一项非常值得探讨的课题。

延伸因子-Tu（Elongation factor Tu，EF-Tu）是存在于真核细胞和细菌细胞中参与RNA 翻译的常见功能性蛋白，在真核生物和细菌的蛋白质生物合成中起着关键作用，具有高度保守性。有研究表明[9]，EF-Tu 可以被分泌到菌体外，并与菌体表面结合，可作为预防病原菌感染的疫苗抗原。但这些不同病原菌的EF-Tu 理化及结构特性、同源性、免疫原性等尚缺少比较分析。研究针对分离保存的引起奶牛乳腺炎的S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus 和E.coli菌株的EF-Tu 基因进行测序和生物信息学分析，为进一步研究该蛋白的交叉免疫保护作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株

实验所用菌株均分离于奶牛乳腺炎病牛乳汁，分离鉴定的S.agalactiae 有8 株、S.dysgalactiae 有1株、S.uberis 有1 株、S.aureus 有1 株、E.coli 有1 株。

1.2 EF-Tu 基因测序及参考菌株基因序列获取

将实验保存的这些菌株送吉林省库美生物公司进行EF-Tu 基因测序。参考菌株基因序列来自于NCBI，共选取72 个菌株的EF-Tu 基因测序，其中S.agalactiae 27 株、S.dysgalactiae 11 株、S.uberis 7 株、S.aureus 17 株、E.coli 10 株。

1.3 方法

1.3.1 EF-Tu 蛋白基本理化性质分析

使用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam）分析EF-Tu 蛋白的理化性质；使用蛋白质在线分析软件ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白EF-Tu 的亲水性或疏水性。

1.3.2 EF-Tu 蛋白二级、三级结构预测

使用PBIL-GERLAND 数据库（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/）中HNN 二级结构预测方法对EF-Tu 蛋白进行预测；采用Swiss-Model 数据库（http：/swissmodel.expasy.org/）同源性模型预测蛋白质的三级结构，并根据数据分析模型准确性。

1.3.3 EF-Tu 核苷酸和氨基酸同源性分析及序列比对

使用NCBI 在线分析网站中的BLAST 功能对各菌株的EF-Tu 核苷酸和氨基酸的序列同源性分析；使用MEGA7 软件对EF-Tu 核苷酸序列进行多序列比对；使用Geneious Prime 软件（网址：https：//www.geneious.com/）中Pairwise/Multiple Align 功能对各菌株的EF-Tu 氨基酸序列进行比对。

1.3.4 EF-Tu 蛋白T 细胞和B 细胞表位预测

使用IEDB 免疫表位数据库（http：//www.iedb.org/）对EF-Tu 蛋白进行表位预测，其中EF-Tu 的T 细胞表位选择MHCⅡ类表位，选取IC50 值小于50 nM 的T 细胞表位；线性B 细胞表位选择Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0 预测方法，阈值设置为0.500，选取阈值大于0.500 的线性B 细胞表位。

2 结果与分析

2.1 EF-Tu 蛋白基本理化性质

S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus 和E.coli EF-Tu 分别由398、398、398、394、409 个氨基酸组成，相对分子质量为44 kda 左右；等电点分别为4.83、4.92、4.97、4.74、5.25；带负电荷的残基（Asp+Glu）总数分别为69、66、67、67、63 个，带正电荷的残基（Arg+Lys）总数为42、42、44、38、47 个；不稳定系数分别为37.57、36.69、36.72、35.86、29.70，均属于理化性质稳定蛋白；平均亲水性数值分别为-0.329、-0.299、-0.320、-0.251、-0.180、-0.287，EF-Tu 存在大量的亲水基团（结果详见图1），属于亲水蛋白。

图1 EF-Tu 蛋白亲水性分析Fig.1 Hydrophilic analysis of EF-Tu proteins

2.2 EF-Tu 蛋白二级、三级结构分析结果

S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus 和E.coli EF-Tu 蛋白分别含有11、13、11、17、19 个α-螺旋区和19、20、20、20、23 个β-折叠区；α-螺旋分别占26.63%、24.37%、22.86%、30.96%、29.58%，β-折叠分别占22.11%、24.62%、23.62%、21.07%、26.41%；无 规 则 卷 曲 分 别 占51.26% 、53.32% 、47.97% 、44.01%、47.59%。表明EF-Tu 可形成结构域，且其中无规则卷曲占比较多，更易形成T 细胞或B 细胞表位，详见图2。

图2 EF-Tu 蛋白二级结构预测Fig.2 Secondary structure prediction of EF-Tu protein

对EF-Tu 蛋白的三级结构预测显示，与在线网站中的模板相比，其一致性分别为73.54%、72.01%、71.25%、73.79%、73.21%，说明预测三级结构真实有效。结果如图3 所示。

图3 EF-Tu 蛋白三级结构预测Fig.3 Tertiary structure prediction of EF-Tu protein

2.3 EF-Tu 核苷酸和氨基酸序列同源性分析及序列比对结果

对这些菌株的EF-Tu 核苷酸和氨基酸序列同源性分析显示，核苷酸序列同源性为100.0%～21.8%，其中S.agalactiae 与S.dysgalactiae 的核苷酸序列同源性最高，为93.8%～94.1%；S.dysgalactiae 和S.uberis与E.coli 的核苷酸序列同源性低，为21.8%～43.9%。而氨基酸序列同源性为100.0%～21.8%，其中S.agalactiae 与S.dysgalactiae 和S.uberis 氨基酸序列同源性高，均超过91%；S.agalactiae 与E.coli 的氨基酸序列同源性最低为68.4%～69.4%（结果见表1）。说明EF-Tu 核苷酸序列同源性变化范围大，且无意义核苷酸突变较多，而氨基酸序列同源性较高。

表1 EF-Tu 基因核苷酸与推导氨基酸同源性分析（%）Table 1 Homology analysis of EF-Tu nucleotide and derived amino acid（%）

选取分离株S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、E.coli、S.aureus 各一株的EF-Tu 氨基酸序列为代表进行氨基酸序列比对。S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis EF-Tu 氨基酸序列相似，仅存在少量的氨基酸突变，但三种链球菌与S.aureus、E.coli EF-Tu 的氨基酸序列存在一些差异（详见图4）。

图4 EF-Tu 蛋白氨基酸序列比对Fig.4 Amino acid sequence alignment of EF-Tu protein

2.4 EF-Tu 蛋白T 细胞和B 细胞表位预测

以 分 离 株S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus、E.coli 各一株为代表，将其EF-Tu 氨基酸序列输入到IEDB 免疫表位数据库中查询，筛选出共同T 细胞表位和B 细胞表位。如图4 所示，在预测的T细胞表位和B 细胞表位中，S.aureus 和E.coli 的EFTu 氨基酸序列54～64 位，存在3 个氨基酸缺失，且其他氨基酸全部突变；在第186～190、269～273、377、388位均存在突变。各个菌株均保守的CD4+T 细胞表位11 个、线性B 细胞表位7 个。结果如表2、表3。

表2 CD4+T 细胞表位预测结果Table 2 Prediction results of CD4+T cell epitopes

表3 线性B 细胞表位预测结果Table 3 Prediction results of linear B-cell epitopes

3 讨论

由于引起奶牛乳腺炎的病原菌种类多，且随着耐药菌株的不断增加，抗生素的治疗效果越来越差，使得接种疫苗成为防治奶牛乳腺炎感染的重要策略。在以往的奶牛乳腺炎疫苗研究中，虽然研究确定了很多候选疫苗抗原，但到目前为止，尚缺少单一抗原蛋白防治多种病原菌感染的候选疫苗的研究。1975 年Lancefield 和同事[10]首次证实，B 群链球菌免疫后，兔体内存在多种特异性保护性抗体以及多血清型交叉保护，使人们认识到GBS 表面蛋白的多样性及其在免疫方面的作用。近年的基因组学和蛋白质组学研究方法与体内外免疫保护作用研究方法相结合，发现了许多具有良好免疫原性的蛋白质抗原，并用于各种疫苗研究开发。由于多种链球菌感染均可引起奶牛乳房炎，因而可诱导机体抗多种链球菌感染的疫苗对预防链球菌性奶牛乳房炎具有重要价值。过去实验室对链球菌共同抗原蛋白GapC 的对小鼠免疫接种发现其可对三种链球菌均具有抗感染能力，由此认为EF-Tu 蛋白作为抗原同样可以诱导交叉免疫保护作用。

早在1981 年，Weiser，J[11]对S.aureus 的EF-Tu蛋白研究发现其具有良好的免疫原性，血清学实验证明S.aureus 的EF-Tu 与E.coli 的EF-Tu 有部分交叉免疫反应，推断其具有结构相似性。后来，在E.coli[12]、猪链球菌[13]、非分型流感嗜血杆菌[14]、猪肺炎支原体[15]、枯草芽孢杆菌[16]、幽门螺旋杆菌[17]等也证明EFTu 蛋白可诱导宿主动物产生免疫反应，且免疫保护率高于60%。这些研究结果为我们选择EF-Tu 蛋白作为预防和控制多种病原菌引起的奶牛乳腺炎的疫苗候选抗原提供了依据。EF-Tu 蛋白种属间具有良好的保守性，且能分泌到胞外并粘附到菌体表面，有成为诱导抗多种病原菌感染候选疫苗抗原的潜力，因此，研究对分离于奶牛乳腺炎病牛乳汁的S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus、E.coli 菌 株EFTu 进行了生物信息学预测分析，结果表明在三种链球菌中EF-Tu 同源性超过91%，与S.aureus 和E.coli同源性也超过68%。对其表位进行预测，选取共同T表位11 个，B 细胞表位7 个，说明其具有良好的免疫原性和一定的交叉免疫保护作用，但尚需要进一步实验进行验证。

4 结论

研究使用生物信息学的方法预测分析，证明S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus、E.coli EF-Tu 发现EF-Tu 在不同种属中均具有较高的核苷酸和氨基酸同源性，并筛选其共同的T、B 细胞表位，说明其具有良好的免疫原性和一定的交叉免疫保护作用，对进一步探讨EF-Tu 作为抗S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus、E.coli 感染疫苗候选抗原提供了参考。