长期定位不同施肥类型对烟田土壤NosZ 细菌群落结构的影响

蒋雨洲，陈顺辉，李文卿，刘青丽，李志宏，张云贵，张燕，周永献，王鹏

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆163319；2.福建省烟草专卖局烟草科学研究所；3.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所）

土壤微生物不仅是土壤生态系统的重要组成部分，还是土壤肥力状况的评价指标之一[1]。土壤微生物受施肥频率和施肥类型等因素的影响[2]。土壤微生物NosZ 基因编码的N2O 还原酶对反硝化过程至关重要[3]，最终会影响土壤N2O 的排放[4-5]。目前研究发现，不同肥料类型对土壤微生物多样性影响的程度和情况都会有所不同，还会对土壤化学过程中硝化和反硝化作用有着不同的影响[6]，周慧等[7]研究表明，与无机氮相比，有机氮投入会促进土壤硝化反硝化过程，并且能够增大土壤微生物NosZ 基因的丰度。还有研究表明，在长期定位施肥条件下，化肥与有机肥对农田土壤微生物群落结构之间呈现出显著性差异[8-11]，尤其是施用有机肥改变农田土壤微生物群落结构及微生物多样性较为明显[12-13]。

目前，有关土壤NosZ 基因微生物群落受化肥或有机肥等不同肥料种类的影响的研究已有报道，但在长期定位施肥条件下，有关集中于NosZ 基因多样性与农田N2O 排放总量之间的关系的研究尚未报道。文章主要通过研究反硝化过程微生物种群的影响及其与农田N2O 排放总量的偶联关系，以期为保护农田生态体系提供合理施肥的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点和品种

试验在福州市晋安区宦溪镇福建省烟草科学研究所科研基地进行，2009 年开始进行定位施肥处理。2008 年水稻收割后试验田0～20 cm 耕层土壤基本养分含量分别为：有机质28.96 g·kg-1，碱解氮144.66 mg·kg-1，速效磷5.85 mg·kg-1，速效钾142.43 mg·kg-1，pH 5.76。土壤类型为沙壤土。微生物取样于2017 年6 月15 日进行。供试烤烟品种为翠碧1 号。

1.2 试验设计与管理

试验从2009 年烤烟生产季开始，2008 年水稻收割后将田块分成3 个小区，每个小区350 m2。采用田间大区试验，共设置3 个处理：对照处理为常规施用化肥处理（T1）；施用化肥+稻草回田处理（T2）；施用化肥+稻草回田+饼肥处理（T3），每个处理设置的小区为350 m2。各处理每年晚稻收割后均进行溶田。每个处理2009-2013 年烤烟生产季施用90 kg·hm-2。化肥氮，N∶P2O5∶K2O＝1∶0.75∶2.63；2014-2017 年烤烟生产季施用97.5 kg·hm-2化肥氮，N∶P2O5∶K2O＝1∶0.75∶2.63；（肥料分别为烟草专用肥N∶P2O5∶K2O＝12∶8∶22，复合肥N∶P2O5∶K2O＝15∶15∶15；硝酸钾N∶P2O5∶K2O＝13∶0∶38 和硫酸钾含K2O 51%）；基肥∶追肥=60∶40。试验当季施用肥全氮含量3.91%，全磷含量10.7 g·kg-1，全钾含量11.92 g·kg-1；稻草全氮含量8.55 g·kg-1，全磷含量1.55 g·kg-1，全钾含量15.36 g·kg-1。每年水稻季N 用量为96.3 kg·hm-2，P2O5用量为70.5 kg·hm-2的和K2O 用量为26.25 kg·hm-2，肥料种类分别为碳铵、过钙（有效磷≥12%）、复合肥（N∶P2O5∶K2O＝15∶15∶15）和水稻专用肥（N∶P2O5∶K2O＝12∶6∶7）。

1.3 样品采集及测定

烤烟施肥移栽前，各小区按梅花5 点取0～20 cm耕层土壤混合样，剔除杂质后，并过5 mm 筛，风干待测定土壤常规理化性质。6 月30 日烟叶采收结束后每处理距离烟株15 cm 处取3 个烟畦纵切面土壤（2 cm 厚度）混合样，风干后测定其化学成分。

烤烟收获季，取烟株根际土壤，每个处理小区各取样3 次重复，剔除杂质后并过2 mm 筛，装于封口袋冷冻保存，进行功能基因多样性分析。

土壤理化性质测定：土壤NO3--N 含量和NH4+-N含量采用0.01 mol·L-1无水氯化钙浸提，德国默克公司生产的Reflectoquant 试剂盒测定。

土壤细菌DNA 提取，PCR 扩增和Miseq 测序：采集的土壤样品送至北京奥维森基因科技有限公司利用Illumina Miseq PE300 平台进行测序分析。采用Power Soil R DNA Isolation kit（MO BIO Laboratories，Inc，CA，USA）试剂盒，按操作步骤说明提取土壤DNA。用1%琼脂糖凝胶进行检测DNA 提取质量和浓度。以稀释后的基因组DNA 为模板，根据测序区域的选择，使用带8-bp Barcode 的特异引物，进行PCR 反应。nifH 上游引物为AAA GGY GGW ATC GGY AAR TCC ACC AC，nifH 下游引物为TTG TTS GCS GCR TAC ATS GCC ATC AT。PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min 后，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循环32 次，循环结束后72 ℃保持7 min，4 ℃条件下结束，收集数据。将同一样本3 次PCR 反应产物的混合物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒（AXYGEN 公司）切胶回收，Tris-HCl 洗脱，2%琼脂糖电泳检测，QuantiFluorTM-ST 蓝色荧光定量系统（Promega 公司）定量检测，最后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。混合后的样品进行Miseq 测序，测序数据已上传 至 NCBI SRA 数 据 库（SRA accession：PRJ －NA542599）。测定样品时，标准品与未知样品同时进行PCR 循环，PCR 反应体系配置如下：2×Taq Plus Master Mix 10 μL，10 mmol·L-1上游引物和下游引物各0.5 μL，加水至18 μL。加入2 μL DNA 后，按以下程序进行PCR：95 ℃，30 s；40 个PCR 循环（95 ℃，5 s；60 ℃，40 s（收集荧光））结合标准曲线计算获得待测样品中nifH 基因拷贝数。

1.4 数据分析

生物信息学分析等由北京奥维森基因科技有限公司完成，原始数据下机后，首先进行数据质控，通过序列拼接、过滤和去嵌合体后得到优化序列，然后进行OTU 聚类及注释，其中OTU 划分基于核苷酸序列97 %相似性水平。

不同处理对土壤nifH 基因拷贝数、Alpha 多样性的影响采用SAS package 9.1（SAS Institute，Cary，NC，USA）进行ANOVA 分析，LSD（P<0.05）进行差异比较；进化发生树通过MAFFT 进行序列对齐，Fast Tree 进行建树，并根据R 语言把其物种的丰度和进化关系进行可视化展示；Venn 图通过R 语言工具统计和作图。

试验数据经EXCEL 2010 整理后作图，并用SPSS 11.5 软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 长期定位施肥对烟田土壤NosZ 细菌α 多样性的影响

如表1 所示，各处理的chao1 指数表现为与T1处理相比，T2 处理和T3 处理分别降低了11.95%和38.26%，各处理间均呈显著性差异，其中以T3 处理最低。从observed_species 来看，与T1 处理相比，T2处理和T3 处理分别降低了11.02%和53.93%，T1 处理和T2 处理均与T3 处理呈显著性差异，其中以T3处理最低。PD_whole_tree 指数的各处理相比，T1 处理＞T2 处理＞T3 处理，T1 处理高于T2 处理和T3 处理，分别为13.06%和74.92%，T1 处理和T2 处理均与T3 处理呈显著性差异，其中以T3 处理最低。在shanoon 指数与T1 处理相比，T2 处理和T3 处理分别降低了3.61%和5.59%，其中以T3 处理最低。各处理的chao1 指数均呈显著性差异，而observed_species和PD_whole_tree 指数的T2 处理与T3 处理，两处理呈显著性差异。说明在稻草回田基础上增施饼肥降低了烟田土壤细菌多样性。

表1 长期定位施肥烟田土壤NosZ 细菌α 多样性分析Table 1 NosZ gene of bacterial α-diversity in tobacco field soil treated with long-term position fertilization

2.2 长期定位施肥对烟田土壤中NosZ 细菌群落结构的影响

如图1 可知，从独有OTU 个数来看，T1＞T2＞T3，分别为1227、910 和405 个；从共有OTU 个数来看，T1 和T2＞T1 和T3＞T2 和T3，分别为453、299 和233个。说明烟田长期投入有机物料对烟田独有细菌种类的影响较大。

图1 长期定位施肥烟田土壤中NosZ 细菌OTU 数的Venn 图Fig.1 Venn of NosZ bacteria OTUs in tobacco field soil treated by long-term position fertilization

2.3 长期定位施肥对烟田土壤中NosZ 基因微生物组成的影响

试验的3 个处理共鉴定出15 个门、26 个纲、57个目、94 个科、180 个属。从表2 可见，细菌所占比例较高（相对丰度＞1%）的主要1 个菌门，为Proteobacteria，介于80.60%～92.13%之间。T1 处理Proteobacteria 的相对丰度为80.60%，T2 和T3 处理分别比T1处理增加了3.05%和14.31%。

表2 长期定位施肥对烟田土壤中含NosZ 基因细菌的组成Table 2 Pearson correlation between relative abundance of NosZ bacteria in tobacco planting soil treated long-term position fertilization

细菌所占比例较高（相对丰度＞1%）的主要2 个菌纲，依次分别为Alphaproteobacteria＞Betaproteobacteria，分别介于65.14%～69.45%和13.87%～21.37%之间，Alphaproteobacteria 的相对丰度T1 处理为65.16%，T2 处理比T1 处理减少了0.03%，T3 处理比T1 处理增加了6.58%；Betaproteobacteria 的相对丰度T1 处理为13.87%，T2 和T3 处理分别比T1 处理减少了11.88%和59.28%。

细菌所占比例较高（相对丰度＞1%）的主要3 个菌 目，依 次 分 别 为Rhizobiales ＞Rhodospirillales ＞Burkholderiales，分别介于45.93%～53.27%、11.66%～19.01%和7.03%～11.20%之间，Rhizobiales 的相对丰度T1 处理为53.27%，T2 和T3 处理分别比T1 处理减少了13.77%和1.33%；Rhodospirillales 的相对丰度T1 处理为11.66%，T2 和T3 处理分别比T1 处理增加了63.12%和44.01%；Burkholderiales 的相对丰度T1 处理为7.47%，T2 处理比T1 处理减少了5.94%，T3 处理比T1 处理增加了49.89%。

细菌所占比例较高（相对丰度＞1%）的主要2 个菌科，依次分别为Bradyrhizobiaceae＞Rhodospirillaceae，分别介于40.54%～47.48%和11.63%～18.99%之间，Bradyrhizobiaceae 的相对丰度T1 处理为47.48%，T2 和T3 处理分别比T1 处理减少了11.61%和9.67%；Rhodospirillaceae 的相对丰度T1 处理为11.63%，T2 和T3 处理分别比T1 处理增加了63.18%和44.16%。

细菌所占比例较高（相对丰度＞1%）的主要3 个菌属，依次分别为Bradyrhizobium＞Rhodopseudomonas＞Azospirillum，分别介于23.35%～25.44%、13.78%～18.30%和11.61%～18.94%之间，Bradyrhizobium 的相对丰度T1 处理为25.44%，T2 和T3 处理分别比T1处理减少了8.21%和3.61%；Rhodopseudomonas 的相对丰度T1 处理为18.30%，T2 和T3 处理分别比T1处理减少了22.83%和24.72%；Rhodopseudomonas 的相对丰度T1 处理为18.30%，T2 和T3 处理分别比T1 处理减少了22.83%和24.72%；Azospirillum 的相对丰度T1 处理为11.61%，T2 和T3 处理分别比T1处理增加了63.08%和44.13%。属水平的细菌丰度在1%以上的有8 个，分别为Bradyrhizobium、Rhodopseudomonas、Azospirillum、Azoarcus、Mesorhizobium、Achromobacter、Massilia 和Thiobacillus。

2.4 长期定位施肥的NosZ 细菌热图分析

如图2 可知，从土壤NosZ 基因细菌β 多样性分析来看，第一次聚类为T1 处理和T2 处理，第二次聚类再与T3 处理相聚。说明，烟田长期投入有机物料对聚类影响较大。

图2 长期定位施肥的土壤NosZ 基因细菌β 多样性分析Fig.2 β diversity analysis of soil NosZ bacteria under long-term position fertilization

2.5 长期定位施肥的细菌进化分支图

如图3 可知，不同施肥处理对烟田土壤细菌进化分支有着不同的影响，从门至属的分类级别由辐射的圆圈内至外，着色为黄色的无显著差异物种所占比例较高，与之相比各处理中体现各自差异的微生物类群较少。各处理中起重要作用的微生物从门来看，T1 处理起重要作用的细菌在门和纲水平未出现；在目水平包括Enterobacterales 和Catenulisporales；在科水平包括Pectobacteriaceae、Catenulisporaceae 和Bradyrhizobiaceae。T2 处理起重要作用的细菌在门和纲水平未出现；在目水平包括Micrococcales；在科水平起重要作用的细菌也未出现。T3 处理起重要作用的细菌在门水平包括Proteobacteria；在纲、目和科水平起重要作用的细菌均未出现。从而说明，稻草回田处理和增施饼肥处理的烟田细菌在纲水平均未出现显著的优势种群，而单施化肥的烟田处理的烟田细菌在目和科水平均有较多的优势种群。

2.6 相关性分析

表3 所示，烟田土壤中含NosZ 基因细菌组成与土壤N2O 排放和无机氮Pearson 相关性分析，土壤中细菌科水平组成中Phyllobacteriaceae 和Alcaligenaceae 相对丰度，分别与土壤无机氮呈极显著正相关和正相关，而均与土壤N2O 排放呈显著负相关。土壤中细菌属水平组成中Mesorhizobium 和Achromobacter 分别与土壤无机氮呈极显著正相关和正相关，而均与土壤N2O 排放呈显著负相关。

表3 长期定位施肥对烟田土壤中含NosZ 基因细菌的组成与N2O 排放和土壤无机氮含量Pearson 相关性分析Table 3 Pearson correlation between relative abundance of NosZ bacteria with N2O emission and inorganic nitrogen contents in tobacco planting soil treated long-term position fertilization

3 讨论

在农业生产过程中，不同耕作制度对农田土壤的理化性质有不同的影响，烟草种植主要以连作制度为主，将使土壤的孔隙度变小[14]，农田中生产并将要释放的N2O 保留空间的容积变小，从而提高了N2O 排放，而有机肥的施用更能增加烟田土壤N2O排放，这一结果与陈哲等[15]研究结论一致，保琼莉等[16]研究指出，农田N2O 排放通量与土壤有效养分有关。由于农田长期种植作物使土壤中氮素消耗，普遍是施用化肥和有机肥进行补偿，维持着肥料氮-土壤氮-作物吸氮之间的关系，而增施氮素肥料会促进农田温室气体的排放[17-18]。研究结果还指出，稻草回田并增加饼肥有利于降低土壤N2O 排放，而且从第一次追肥至烤烟生长结束N2O 排放总量和采收期土壤无机氮含量与细菌群落组成中变形菌门（Proteobacteria）进行相关性分析，与土壤无机氮呈极显著正相关，而与土壤N2O 排放呈负相关，因此，在稻草回田基础上再添加饼肥，能够提高作物易于吸收的无机氮含量，减少农田土壤氮损失，降低烟田N2O 排放总量。这也是由于长期施用饼肥并覆盖稻草，可有效增加土壤养分有效性[19]，从而增加了作物的吸收利用，降低了土壤N2O 排放，而研究结果表明长期施用饼肥并覆盖稻草降低土壤N2O 排放，虽与前人研究较为一致，但其机理过程还需进一步探究。

施用有机肥料与无机肥料分别对土壤微生物多样性的影响也有相关的报道。TIAN 等[20]研究结果指出，通过3 年长期定位试验，施用有机肥料与无机肥料相比，可以降低土壤微生物多样性。试验结果表明，与单施化肥处理相比，稻草回田或再增加饼肥处理的烟田α 多样性均降低，与TIAN 等人的研究结果一致，但是关于在更长时间的长期定位施肥条件下，观测并对比烟田根际土壤细菌α 多样性的影响规律是否与较短年限所呈现的结果依然一致，还有待进一步探究。

生物固氮是指在固氮微生物的作用下将空气中的氮气还原成氨的过程，是大气氮素进入生态系统物质循环的主要途径之一，土壤中古菌和细菌等多种类群都有固氮能力[21-23]，但土壤细菌群落结构易受有机肥料的影响，烟田施入有机肥导致土壤理化性质和微生物活性改变，从而改变了微生物群落多样性[24-25]。研究的结果表明，与单施化肥相比，稻草回田或再增加饼肥降低了独有OTU 个数，而稻草回田并添加饼肥更降低了独有OTU 个数。蒋雨洲等[26]研究结果表明在东北黑土的长期定位试验条件下，土壤微生物多样性受施肥类型的影响，与施加有机肥处理相比，单施化肥处理的土壤微生物多样性略低，而且研究还指出稻草回田并增施饼肥处理对聚类影响较大，因此，进一步得到了验证。

农田施肥可以向土壤中输入养分，刺激微生物生长繁殖，从而影响土壤微生物的丰度、活性、微生物量和微生物群落结构[27-28]，研究通过LEf Se 进化分支图还发现，在烟田细菌目水平组间差异相比，各处理中单施化肥的烟田细菌目水平组间差异较高的是Enterobacterales（肠杆菌目）和Catenulisporales（放线菌目）有关目的物种，稻草回田的烟田细菌目水平组间差异较高的是Micrococcales（微球菌目）有关目的物种，均属于变形菌门（Proteobacteria）。Roesch 等[29]研究指出农田土壤细菌微生物多样性主要为丰度最高的Proteobacteria 菌门，研究结果与之较为一致，而研究结果还指出，有机肥投入的处理Proteobacteria 菌门丰度高。由于变形菌门（Proteobacteria）对土壤的氮和有机质循环有重要作用[30-32]，而农田施入有机肥还能够改良土壤理化性质，促进有益菌生长[33]，在烤烟采收后的根系分泌物的影响所致[34]，还需进一步探究。

4 结论

（1）不同施肥类型对植烟土壤N2O 排放有着不同的影响，稻草回田并添加饼肥能够改善植烟土壤N2O 排放。

（2）稻草回田和稻草回田并添加饼肥对土壤独有OTU 个数影响较大，而长期稻草回田并添加施饼肥对烟田独有OTU 个数影响更大，但与单施化肥相比，稻草回田或再增加饼肥降低了α 多样性。

（3）在细菌群落组成中仅有变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度＞5%，且稻草还田并添加饼肥处理最高。

（4）不同施肥类型对植烟土壤微生物LEf Se 进化分支图有明显影响，单施化肥的烟田土壤细菌表现优势的细菌种群主要是Enterobacterales 和Catenulisporales，而稻草还田的烟田土壤细菌表现优势的细菌种群主要是Micrococcales 有关目的物种。