不同烤烟种植模式对贵州土壤养分、酶活性及细菌群落结构的影响

芶久兰 顾小凤 张 萌 魏全全 柳玲玲

(贵州省农业科学院土壤肥料研究所，贵州 贵阳 550006)

烟草(Nicotianatabacum)是我国重要的经济作物之一。据统计，2019年贵州烤烟种植面积达194万亩，是我国第二大烤烟种植省份，仅次于云南[1]。然而，随着近年来贵州烤烟产业的快速发展，烤烟连作现象越来越突出。烤烟连作不仅影响烟叶质量与品质，而且会使土壤养分失衡，进而影响土壤微生态环境[2-3]。因此，如何合理有效地缓解贵州烤烟连作障碍、均衡土壤地力水平以及改善土壤微生态环境，成为目前亟待解决的重要问题。

近年来，通过合理轮作来改善和解决烤烟连作障碍的研究日益增多。合理轮作可以明显增加土壤中细菌数量，显著降低真菌数量，提高群落多样性[4]。不同耕作方式、作物类型、施肥和种植制度的变化均会影响或改变土壤微生物群落功能多样性[5-10]。烤烟轮作对土壤的影响主要集中在对土壤理化性质及根际微环境的影响。研究发现烤烟与豆科植物进行轮作能增加土壤养分含量[11]。吴文涛等[12]和黎妍妍等[13]研究均表明，烟草与万寿菊轮作可以有效提高土壤中自生固氮菌、无机磷细菌等有益功能菌群的数量，提高烟株根际土壤细菌群落Shannon和Chao1等多样性和丰富度指数，并且增强土壤细菌群落响应胁迫的修复能力。同时有学者发现,玉米是控制烟草枯萎病的有效轮作作物，玉米烤烟轮作可以提高土壤中酸性细菌和放线菌的丰富度[14]。钏有聪等[15]通过大蒜与烤烟轮作对烟草黑胫病的防治效果及作用机理进行初探，发现大蒜和烤烟轮作可以降低烟草黑胫病的发生和危害。陈丹梅等[16]研究则指出烤烟-苕子-水稻的轮作模式可改善土壤生态环境，促进微生物繁衍。由此可见，合理的烤烟轮作可以有效均衡土壤养分，改善土壤环境，有助于烤烟良好循环种植。

绿肥作为一种重要的有机肥料，在减少化肥用量、提高作物产量、培肥土壤地力等方面发挥着积极作用。包明等[17]研究指出，在渭北旱塬地区施用绿肥一定程度上可提高该区域的土壤肥力。同时，绿肥可促进烤烟根际微生物的生长和繁殖，提高烟田土壤细菌群落多样性及均一度[18]。杨帅等[19]发现将绿肥与烤烟进行轮作，能够显著提高土壤有效氮的转化，保证烟株氮素的供应；绿肥轮作后能改善植烟土壤细菌结构，提高有机质、全氮、速效养分含量，从而提供大量碳源和氮源，使土壤细菌Shannon指数明显提高[20]。张超[21]的研究证明，绿肥还能提高土壤酶活性，改善土壤微生态条件，从而减轻作物土传性病害发病率。不同绿肥之间，禾本科绿肥对土壤微生物量和土壤酶活性的影响最大，其次是豆科绿肥[22]。以往关于烤烟合理轮作的研究已有报道，但针对贵州烤烟轮作的研究较少。因此，本研究通过大田试验，定量分析不同烤烟种植模式对贵州土壤养分、酶活性及细菌群落结构的影响，以期为贵州烤烟的合理高效种植模式提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

本试验于2018年10月—2020年8月在贵州省毕节市黔西县永燊彝族苗族乡(106°11′41″E，27°7′34″N)进行，平均海拔1 205 m。供试土壤为贵州典型石灰岩发育的黄壤，其基本理化性质如下：pH值5.92，有机质含量18.59 g·kg-1，全氮含量1.31 g·kg-1，有效磷含量16.60 mg·kg-1，速效钾含量232.00 mg·kg-1。 供试烤烟品种为毕纳1号，由毕节市烟草公司黔西县分公司提供。供试有机肥为酒糟有机肥(N+P2O5+K2O=6.2%)，供试化肥为烤烟专用基肥(N∶P2O5∶K2O=10∶15∶24)、烤烟提苗肥(N∶P2O5∶K2O=15∶8∶7)和烤烟专用追肥(N∶P2O5∶K2O=13∶0∶126)，均由毕节市烟草公司黔西县分公司提供。绿肥品种为66-25箭筈豌豆，由毕节市黔西县土肥站提供。

1.2 试验设计

试验采取随机区组试验设计，设置4个处理：烤烟连作(T)；白菜-烤烟轮作(C-T)；豌豆-烤烟轮作(P-T)；绿肥-烤烟轮作(GM-T)。每个试验小区面积为42 m2，不同小区设置0.5 m隔离带，每个处理设置3次重复。烤烟行距1.05 m，株距0.57 m，种植密度16 500株·hm-2。在烤烟种植过程中，每个小区的管理方式一致。在施肥过程中，根据等量养分原则，T和C-T处理施肥一致，P-T处理直接将豌豆翻压于地里，GM-T处理直接将绿肥翻压于地里，豌豆和绿肥的养分含量及水分含量如表1所示，计算后将P-T和GM-T的专用基肥和追肥分别减少80 kg·hm-2和110 kg·hm-2。各处理具体施肥量如表2所示。

表1 豌豆和绿肥的养分含量情况Table 1 Nutrient content of pea and green manure /%

表2 不同处理的肥料施用量Table 2 Fertilizer application amount for different treatments /(kg·hm-2)

1.3 土壤样品的采集

本试验于2020年8月烤烟采收结束后，在每个小区按照“S”型土壤取样法设置15个采样点，每个采样点采集0～20 cm土壤样品。将枯枝落叶、碎石等杂物剔除后把每个土壤样品分为三部分：第一部分用锡箔纸包裹，迅速装入离心管，投入液氮冷冻运输，之后转移至-80℃冰箱保存，用于土壤微生物高通量测序分析；第二部分采集新鲜土样用于铵态氮(ammonium nitrogen, AN)、硝态氮(nitrate nitrogen, NN)、微生物量碳(microbial biomass carbon, MBC)、微生物量氮(microbial biomass nitrogen, MBN)和微生物量磷(microbial biomass phosphorus, MBP)的测定；第三部分将新鲜样品自然风干、研磨过筛后用于土壤pH值、有机质(soil organic matter, SOM)、阳离子交换量(cation exchange capacity, CEC)、全氮(total nitrogen, TN)、有效磷(available phosphorus, AP)、速效钾(available potassium, AK)、脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶和过氧化氢酶的测定。

1.4 测定项目与方法

1.4.1 土壤理化性质测定 土壤理化性质按照《土壤农化分析》[23]进行。土壤pH值采用电位测定，土壤有机质采用重铬酸钾容量法-外加热法测定，土壤CEC采用BaCl2-MgSO4强迫交换法测定，土壤全氮含量采用半微量凯氏定氮法测定，土壤铵态氮和硝态氮用1 mol·L-1KCl溶液浸-连续流动分析仪(AA3，德国布朗卢比公司)测定，土壤有效磷采用盐酸-氟化铵提取-钼锑抗比色法测定，土壤速效钾采用醋酸铵-火焰光度计(FP640，上海傲谱分析仪器有限公司)法测定，土壤微生物量碳、微生物量氮和微生物量磷采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法测定，脲酶采用靛酚蓝比色法测定，蔗糖酶采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定，酸性磷酸酶采用硝基酚比色法测定，过氧化氢酶采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定。

1.4.2 土壤DNA提取和16S rRNA基因高通量测序 每个样品称取相当于0.5 g干土重量的新鲜土壤，采用FastDNA®SPIN Kit for Soil(MPBiomedicals)试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取土壤微生物总DNA，1%琼脂糖电泳检测DNA样品是否降解以及有无杂质，使用Nanodrop 2000分光光度计[赛默飞世尔科技(中国)有限公司提供]检测样品纯度。经DNA浓度和纯度检测后(DNA浓度≥20 ng·μL-1，总量≥500 ng，D260/280为1.8～2.0)，利用ABI Gene Amp®9700型PCR仪[美国应用生物系统公司(ABI)]对细菌16S rRNA基因进行PCR引物扩增，扩增引物为338F(5′-A C T C C T A C G G G A G G C A G C AG-3′)和806R(5′-G G A C T A H V G G G T W T C T A AT-3′)。PCR反应体系为20 μL：5×TransStart FastPfu缓冲液4 μL，2.5 mol·L-1dNTPs 2 μL，上游引物(5 μmol·L-1) 0.8 μL，下游引物(5 μmol·L-1) 0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，用灭菌蒸馏水补足至20 μL。PCR扩增程序：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，27个循环；72℃终延伸10 min，4℃保存。每个样本3个重复，获得扩增产物后，进一步通过2%琼脂凝胶电泳检测PCR产物纯化效果，测定纯化后PCR产物的浓度，将土壤样品16S rRNA基因的PCR纯化产物等按摩尔系数混合，利用Thermo Scientific 公司(上海)的GeneJET胶回收试剂盒，割胶回收目标条带，测序服务委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.5 统计与分析

采用Mothur软件计算多样性指数，包括Chaol、Shannon和Simpson指数，采用Canoco 4.5 软件进行冗余分析(redundancy analysis，RDA)，采用Origin 8.0软件进行作图，利用SPSS 20.0软件进行方差分析。图表中数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 种植模式对土壤养分的影响

由表3可知，烤烟轮作后，土壤pH值提升了1.19%～1.58%。此外，轮作在一定程度上对土壤养分含量也产生了影响，提升了土壤有机质、阳离子交换量、全氮、微生物量碳、微生物量氮和微生物量磷含量。与T处理相比，烤烟轮作使SOM、CEC、TN、MBC、MBN和MBP分别提高了0.77%～12.44%、10.78%～38.51%、11.76%～17.65%、10.65%～20.67%、36.58%～160.36%和14.66%～36.21%，均以GM-T处理增幅最大，GM-T处理与其余处理的MBN含量达显著差异水平。与T处理相比，轮作的土壤铵态氮、硝态氮、有效磷和速效钾含量有所降低，分别降低了1.01%～71.67%、19.29%～24.32%、23.09%～52.21%和6.18%～10.09%，且轮作各处理的硝态氮和有效磷含量均与T处理间差异显著。

表3 不同处理的土壤养分含量Table 3 Soil nutrient status of different treatments

2.2 种植模式对土壤酶活性的影响

如表4所示，烤烟轮作对土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶和过氧化氢酶活性有不同程度的影响。与T处理相比，烤烟轮作使土壤脲酶和蔗糖酶活性分别提高了12.38%～42.96%和4.00%～22.67%，均以GM-T处理最高，GM-T的脲酶活性与T和C-T两处理间差异显著；烤烟轮作使酸性磷酸酶和过氧化氢酶活性分别降低了8.16%～24.17%和2.66%～15.80%，其中C-T处理的酸性磷酸酶活性与T处理差异显著，各处理的过氧化氢酶活性差异均不显著。

表4 不同处理的土壤酶活性Table 4 Soil enzyme activities of different treatments

2.3 种植模式对土壤细菌群落组成的影响

通过对土壤样品进行检测发现(图1)，土壤细菌共得到21 952个操作分类单元(operational taxonomic units, OTU)，其中T、C-T、P-T和GM-T处理的OTU数量分别为7 764、7 937、7 910和9 830个。4个处理的共同OTU为1 827个，分别占T、C-T、P-T和GM-T处理总OTU数量的23.5%、23.0%、23.1%和18.6%。T、C-T、P-T和GM-T处理各自特有的OTU数分别为3 360、 3 414、3 385和5 458，占相应处理总OTU数量的43.3%、43.0%、42.8%和55.5%。

图1 土壤中细菌OTU数量Venn图Fig.1 Venn diagram of bacteria OTU in soil

2.4 种植模式对土壤细菌群落多样性指数的影响

由表5可知，烤烟轮作改变了土壤细菌群落多样性指数。与T处理相比，烤烟轮作提高了Chaol和Shannon指数，增幅分别为1.5%～11.1%和0.3%～3.2%，均以GM-T处理增幅最大。烤烟轮作处理降低了Simpson指数，降幅为0.0%～0.2%，以GM-T处理降幅最大。综上，绿肥-烤烟轮作模式可以更好地提高土壤细菌群落多样性。

表5 种植模式对土壤细菌群落多样性指数的影响Table 5 Effects of planting patterns on soil bacterial community diversity index

2.5 种植模式对土壤细菌群落丰度和多样性的影响

2.5.1 种植模式对土壤细菌门水平群落结构的影响 通过对不同种植模式下的土壤细菌群落组成进行分析发现，在门水平上共检测出34个细菌种类和未确定类群，T、C-T、P-T和GM-T处理分别有26、32、26和29个门(图2)。其中，变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)的相对丰度较高，分别为30.8%～38.3%、24.9%～36.8%、9.9%～11.9%、7.9%～11.3%和6.1%～7.3%。进一步分析发现，烤烟轮作改变了土壤中细菌优势菌种的丰度。与T处理相比，烤烟轮作使土壤中变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度提高了0.4～7.5个百分点，而酸杆菌门(Acidobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)的相对丰度则分别降低了0.6～2.0个百分点和1.9～3.4个百分点。

图2 种植模式下土壤细菌门水平上主要菌落相对丰度Fig.2 Planting patterns of major microflora at phylum level in soil

图3 种植模式下土壤细菌属水平上主要菌落相对丰度Fig.3 Planting patterns of major microflora at genus level in soil

2.5.2 种植模式对土壤细菌属水平群落结构的影响 在属水平上共检测出909个细菌种类和未确定类群，T、C-T、P-T和GM-T处理分别有597、666、610和687个属(图3)。其中，JG30-KF-AS9、嗜食单胞菌(Sphingomonas)、链霉菌(Streptomyces)、芽单胞菌属(Gemmatimonas)和拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)的相对丰度较高，分别为3.4%～5.7%、3.2%～5.6%、1.7%～4.4%、2.7%～3.1%和0.9%～2.7%。进一步分析发现，与T处理相比，烤烟轮作使嗜食单胞菌(Sphingomonas)、罗丹杆菌(Rhodanobacter)和杆菌属(Bryobacter)相对丰度分别提升0.9～2.4个百分点、0.2～0.5个百分点和0.2～0.4个百分点，均以P-T处理增幅最高；链霉菌(Streptomyces)相对丰度下降0.4～2.6个百分点。

2.5.3 种植模式对土壤微生物群落结构影响的线性判别分析及影响因子 通过对不同种植模式下的土壤细菌群落进行LefSe分析发现(图4)，轮作可以增加土壤中有重要作用的微生物类群数量，T处理仅有2种，C-T处理增加至5种，P-T处理增加至3种，GM-T处理增加至6种。进一步分析发现，在各个处理中，对土壤具有重要作用的细菌各不相同，具体表现如下：T处理为Pedosphaeraceae；C-T处理有嗜红杆菌(Altererythrobacter)、诺卡氏菌(Nocardia)、放线菌(Actinophytocola)和拟无枝酸菌(Amycolatopsis)；P-T处理有柯氏杆菌(Coxiella)；GM-T处理为粘菌(Mucilaginibacter)、关节杆菌(Arthrobacter)、Pedosphaeraceae、Devosiaceae和变形细菌(Proteobacteria)。

图4 土壤细菌群落LefSe分析Fig.4 LefSe analysis of soil bacterial community

2.6 土壤细菌群落结构与土壤养分的冗余分析

根据统计分析的结果，将土壤养分与细菌群落前16个优势菌属进行RDA冗余分析(图5)，结果显示，第1轴解释率为38.1%，第2轴解释率为28.5%，累积解释率为66.6%。MBP对群落变异的解释度为23.5%，AP为22.1%，AN为18.9%，因此推测MBP是驱动群落变异的主要因子。MBP与黄杆菌属和褚氏杆菌属，AP和AN与链霉菌属和拟无枝酸杆菌均呈正相关关系。

图5 土壤细菌群落结构与土壤养分的冗余分析(属水平)Fig.5 Redundancy analysis of soil bacterial community structure and soil nutrient (genus)

3 讨论

3.1 种植模式对土壤养分的影响

连作会导致土壤酸化，降低土壤肥力[24]。轮作不仅能够提高土壤肥力，提升土壤的有机质和全氮含量[10]，而且可以改善烟草健康状况[21]。本试验发现，轮作后的土壤pH值较连作处理有所提升，这可能是因为长期连作会降低土壤微生物多样性和酶活性，使土壤酸化。可见，烤烟轮作可改善连作带来的土壤酸化问题。

轮作后的土壤有机质、阳离子交换量、全氮、微生物量碳、微生物量氮和微生物量磷含量均有明显提高，且以GM-T处理效果最佳，P-T处理次之，这与谭玉兰等[25]和贾志红等[26]的研究结果一致，一方面是因为烤烟生长过程中，氮素是最重要的元素，烤烟连作造成了土壤中氮素缺失，而轮作可减轻土壤中氮素的供给压力；另一方面，豆科植物具有固氮作用，可以优化土壤的理化性质，熟化土壤肥力，能够有效改善土壤质量[27-28]，同时有学者[21, 29]证明绿肥-烤烟轮作能够明显增强土壤中活性有机质的含量，从而提高土壤中碳和氮的含量。

在本试验中，与连作处理相比，轮作处理土壤中的铵态氮、硝态氮、有效磷和速效钾含量有所降低，与前人[30-33]研究结果一致，这可能是因为在施入养分含量相同的情况下，轮作提高了烤烟的根系根长，扩大了根系与养分的接触面积，提高了养分的吸收量[30]，所以连作烤烟可能导致土壤中速效养分的累积，造成土壤养分失衡。

土壤中的磷酸酶和脲酶活性在一定程度上可分别反映土壤中有机磷的生物有效性和供氮能力，蔗糖酶活性反映土壤熟化程度和肥力水平，过氧化氢酶活性可以用来表征土壤腐殖化强度和有机质的积累程度[22]。连作使土壤中酶活性受到抑制，而轮作可以提高土壤中的酶活性[34-35]。在本试验中，烤烟轮作提高了土壤中的脲酶和蔗糖酶活性，这与张科等[31]和官会林等[36]的研究结果一致。本试验的3个轮作处理中，GM-T处理提升效果最好，一方面可能是因为绿肥腐解过程中，需要大量微生物的参与，微生物活性增强，从而促进了土壤酶活性的提高[37]；另一方面，绿肥能够固氮、吸碳，在烟株根系发育过程中提供大量有机营养，使根系分泌物增多，微生物繁殖速度加快，从而提高了土壤酶活性[38]。

3.2 种植模式对土壤细菌群落结构多样性的影响

土壤微生物在维持土壤肥力、促进土壤养分循环等方面具有重要的作用[39]。种植模式的改变必然会直接或间接地影响土壤微生物群落多样性。研究表明，烤烟轮作和绿肥还田可以明显增加土壤细菌和放线菌数量，增加土壤微生物的生物多样性，改变微生物群落结构[40-42]。本研究发现，T处理的OTU数量和土壤细菌种类均为最少；而烤烟轮作改变了细菌群落结构多样性，与T处理对比，C-T处理中放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度提升，GM-T处理提升了变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度，与前人研究结果较为吻合[16，40]。这是因为烟草在连作条件下，根系分泌物中有毒物质的积累可使根系受害，影响根系微生物的数量、种群和土壤微生物的代谢、生长和发育，而且烤烟连作破坏了烟草根际土壤细菌群落的平衡，使烟草的生存微环境不断恶化；而轮作方式可以提高植烟土壤细菌群落的多样性，并且随轮作年份的增加，轮作处理根际土壤细菌含量高于单作烤烟的趋势越来越明显[43-44]。GM-T处理的绿肥为豆科植物，根部聚集固氮菌进行大量固氮，导致土壤氮源增加，变形菌门随之增加[45]。

烤烟连作降低了表征菌群丰度的Chaol指数和物种丰富度的Shannon指数[6]。在本研究中，烤烟轮作处理的Chaol和Shannon指数均高于连作，特别是GM-T处理，与段玉琪等[43]的研究结果一致。这是因为种植绿肥可调节土壤碳氮比，提供大量碳源和氮源从而影响土壤微生物活性，改变土壤微生物群落组成和功能，使土壤细菌中Shannon指数明显提高[20, 46]。杆菌类细菌是土壤中可促进作物生长，增强土壤中难分解肥效元素的分解和抑制土传病菌危害的多功能微生物[47]。在连作土壤中添加杆菌，能有效克服设施蔬菜的连作障碍，降低连作障碍病原菌数量，提高土壤酶活性，并促进植株生长[48]。本试验中LefSe分析显示，烤烟轮作后，土壤中有重要作用的微生物类群数量增多，主要增多的微生物类群为杆菌类，与细菌属水平群落结构分析的结果一致；同时冗余分析显示，MBP是驱动群落变异的主要因子，且MBP与杆菌类细菌呈正相关关系。这与前文提到的研究结果一致，说明烤烟轮作能有效提高土壤中的有益菌群，从而改善土壤条件并促进烤烟生长。

4 结论

本研究结果表明，烤烟轮作可均衡土壤中的养分含量，提高土壤酶活性。轮作后，土壤细菌群落结构和多样性有所改善，变形菌门(Proteobacteria)、嗜食单胞菌(Sphingomonas)、罗丹杆菌(Rhodanobacter)和杆菌属(Bryobacter)的相对丰度有所提高。MBP是驱动群落变异的主要因子，通过改变杆菌类细菌来达到改善土壤微环境的效果。因此，在贵州进行烤烟轮作，特别是绿肥-烤烟轮作制度能够在一定程度上提高土壤养分含量，并增加土壤有益微生物菌群，为烤烟的良好循环种植提供基础。