茶多酚和硫辛酸对谷氨酸发酵的影响

张顺棠,刘继东

(莲花健康产业集团股份有限公司,河南 项城 466200)

抗氧化剂是阻止氧气不良影响的物质,它是一类能帮助捕获并中和自由基,从而降低自由基对机体损害的一类物质。常用的抗氧化剂有维生素类抗氧化剂、酚系抗氧化剂、胺系抗氧化剂和含硫化合物抗氧化剂等。日本味之素公司城照雄等研究表明:谷氨酸发酵中,在培养基中有抗氧化剂存在的时候,可以防止菌体成分的氧化,使谷氨酸生成酶系能够维持较长时间和较高活性,菌体细胞的老化和培养时间的延迟均能得到根本改善[19]。笔者在谷氨酸发酵培养基中分别添加不同比例的抗氧化剂茶多酚和硫辛酸,利用茶多酚和硫辛酸的抗氧化特性,防止谷氨酸菌体细胞质膜及细胞壁的主要组成分磷脂质的氧化,清除过量的自由基,减少自由基积累对菌体的氧化损伤,延缓菌体细胞衰老,延长菌体高产酸期持续时间。研究茶多酚和硫辛酸对谷氨酸菌体生长和产酸的影响,探讨其合适的添加比例,以提高谷氨酸生产效率。

1 设备与仪器

50 L发酵罐、10 L种子罐、温度、风量、pH数显自控,上海国强生化装备有限公司;754分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;SBA-40C生物传感仪,山东省科学院生物研究所;振荡培养箱,上海智诚分析仪器制造有限公司;ES-A标准天平,天津市德安特传感技术有限公司;DYS-40研究型生物显微镜,上海点应光学仪器有限公司。

2 材料与配方

2.1 主要材料

谷氨酸棒杆菌“LHWJ-19”,莲花健康产业集团股有限公司保藏;茶多酚,宜昌清江茗研生物科技有限公司;硫辛酸,江苏采薇生物科技有限公司;葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏,上海天莲精细化工有限公司;生物素,日本进口分装;硫酸锰、硫酸亚铁,国药集团化学试剂有限公司;尿素、氢氧化钠、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钠,上海凌峰化学试剂有限公司;玉米浆,山东西王糖业有限责任公司;糖蜜,柳州市金黔湾糖蜜有限公司。

2.2 培 养 基

2.2.1 斜面培养基

葡萄糖,20 g/dL;磷酸氢二钠,0.12%;硫酸镁,0.06%;玉米浆,0.25%;糖蜜,0.25%;尿素,0.6%;消泡剂,0.1%;硫酸亚铁,2 mg/kg;硫酸锰,2 mg/kg;生物素,2 mg/kg;pH 7.0～7.2。

2.2.2 种子培养基

葡萄糖,4.0 g/dL;尿素,0.5%;硫酸镁,0.05%;玉米浆,3.0%;磷酸氢二钾,0.14%;硫酸亚铁,2 mg/kg;硫酸锰,2 mg/kg;pH 7.0～7.2。

2.2.3 发酵培养基

葡萄糖,10 g/dL;磷酸氢二钠,0.12%;硫酸镁,0.06%;玉米浆,0.25%;糖蜜,0.25%;硫酸亚铁,2 mg/kg;硫酸锰,2 mg/kg;生物素,2 mg/kg;pH 7.0。

3 培养方法

3.1 菌种活化

取保藏菌种划线接种于活化斜面培养基,30 ℃恒温静置培养10～12 h。

3.2 种子培养

利用接种环刮取斜面菌种数环,接入灭菌后的摇瓶培养基,摇床转速100 r/min,温度30 ℃,培养8～10 h。

3.3 二级种子培养

种子罐培养基115 ℃灭菌20 min;当温度降低到33 ℃时,接入摇瓶培养好的一级种子;控制温度33.0～33.5 ℃,pH 7.0～7.1,通风量(按通风体积比)1∶0.15～1∶0.25,罐压0.1 MPa,培养8～11 h;当OD净增0.45以上时,将二级种子移入发酵罐。

3.4 谷氨酸发酵培养

发酵罐培养基初定容量10%,115 ℃灭菌20 min;当温度降低到34 ℃时,移入种子罐培养好的二级种子开始发酵。

1) 温度控制:0～6 h,34 ℃;6～12 h,35 ℃;12～18 h,36 ℃;18～24 h,37 ℃;24～28 h,38 ℃;28 h～放罐,39 ℃。

2) 转速控制:当OD为0时,400 r/min;当OD净增0.2～0.25时,500 r/min;当OD净增0.4～0.65时,600 r/min;当OD净增0.85以上时,700 r/min。

3) 通风量控制:当OD为0时,1∶0.12～1∶0.15;当OD净增0.2～0.25时,1∶0.20;当OD净增0.4～0.65时,1∶0.30～1∶0.35;当OD净增0.85以上时,1∶0.35～1∶0.45。发酵后期可根据生产情况适当调整通风量,但不能低于零时通风量。

4) pH控制:0～2 h,pH 7.0～7.2;2～26 h,pH 7.0～6.8;26 h以后pH 6.7～6.8;放罐pH 6.4～6.7。

5) 流加糖控制:当残糖质量浓度≤3.0 g/dL时流加浓缩高糖,流加糖质量分数为45 g/dL。

6) 耗糖的控制:菌株生长期每2 h耗糖4.0～6.0 g/dL;产酸期每2 h耗糖1.5～2.0 g/dL;发酵后期每2 h耗糖0.5～1.0 g/dL。当耗糖过慢时可适当降低通风量或pH并提高温度,当耗糖过快时可适当提高通风量或pH以使发酵平稳。

3.5 检测方法

1) 菌体OD值检测:利用754分光光度计于600 nm测定,以蒸馏水为空白。

2) 葡萄糖液质量浓度测定:利用SBA-40C生物传感仪测定,吸取标准葡萄糖液25 μL进样标定,到标定结束,取葡萄糖液10 μL,稀释100倍后,取25 μL稀释液进样,读取葡萄糖的质量浓度。

3) 谷氨酸质量浓度测定:利用SBA-40C生物传感仪测定。

3.6 计算方法

1) 谷氨酸质量=谷氨酸质量浓度×发酵液体积。

2) 葡萄糖质量=葡萄糖质量浓度×葡萄糖液体积。

3) 糖酸转化率=谷氨酸质量÷葡萄糖质量×100%。

4 结果与讨论

4.1 添加茶多酚对谷氨酸发酵的影响

茶多酚又称茶单宁、茶鞣酸、茶鞣质,是一类以α-苯基苯并吡喃为基本结构的多羟基酚类复合体的统称,包含黄烷醇(儿茶素)类、黄酮类等30余种化合物[20]。茶多酚属于链终止型抗氧化剂,含有不稳定的—H,自身易失去—H被氧化,而活性氧化基团因接受—H得到电子变成稳定的非活性基团,抗氧化剂非活性基团的形成切断了活性氧化基团进一步的氧化连锁反应,从而起到抗氧化作用。生物体内自由基的生成与相关的氧化酶有关,如黄嘌呤氧化酶系、脂氧化酶和环氧酶等,茶多酚对以上氧化酶有抑制作用,通过抑制氧化酶减少自由基的产生。茶多酚的抗氧化性表现为直接和间接清除自由基[21],茶多酚对活细胞产生的氧自由基综合清除效果明显[22]。笔者在发酵培养基中分别添加10,20,30,50 mg/kg的茶多酚,与在发酵培养基中不添加茶多酚进行平行实验,茶多酚对谷氨酸菌体OD值影响如图1所示,对谷氨酸质量浓度的影响如图2所示。

图1 茶多酚对谷氨酸菌体生长曲线的影响

图2 茶多酚对谷氨酸质量浓度的影响

由图1可知:在发酵培养基中添加不同质量分数的茶多酚,发酵前期菌体的生长曲线基本一致,没有明显变化,说明茶多酚对前期谷氨酸菌体生长阶段影响不明显;与茶多酚0添加量时相比,添加10 mg/kg的茶多酚时,发酵中后期菌体OD值变化不明显;当茶多酚添加量增加到20 mg/kg时,发酵中期菌体OD值明显提高,后期菌体OD值降低速度明显放缓;当茶多酚添加量增大到30 mg/kg和50 mg/kg时,发酵中后期菌体OD值与添加量为20 mg/kg时基本一致,后期OD值下降速度放缓,趋于稳定,添加过量的茶多酚时菌体OD值不再改变。由图2可知:随着茶多酚添加量的增加,谷氨酸质量浓度明显提高,当添加量达到20 mg/kg时,谷氨酸产酸率达到最大值16.6 g/dL,与0添加量相比,谷氨酸质量浓度提高0.5 g/dL;当添加量继续加大时,谷氨酸质量浓度基本稳定,不再升高。综上所述,发酵培养基中添加一定量的茶多酚,在发酵中期菌体OD值增高,后期OD值下降速度放缓,菌体老化速度变缓,可以提高谷氨酸的质量浓度,茶多酚适合的添加量为20 mg/kg,此时的谷氨酸质量浓度为16.6 g/dL。

4.2 添加硫辛酸对谷氨酸发酵的影响

硫辛酸也称α-硫辛酸,是一种天然的二硫化合物,其化学名称为1,2-二硫戊环-3-戊酸,是一种B族维生素[23]。硫辛酸是已知的天然抗氧化剂中抗氧化能力最强的一种,被称为“万能抗氧化剂”[24],是代谢过程中三羧酸循环不可缺少的物质,在三羧酸循环过程起辅酶作用[25]。硫辛酸可直接清除自由基(·OH)、活性氧(ROS)、活性氮(RNS)、单线态氧(1O2)和一氧化氮(NO)等[26],并能阻止自由氧对组织细胞的损害,起到延缓细胞衰老的作用。笔者在发酵培养基中分别添加10,20,30,50 mg/kg的硫辛酸,与在发酵培养基中硫辛酸0添加进行平行实验,硫辛酸对谷氨酸菌体OD值的影响情况如图3所示,对谷氨酸质量浓度的影响情况如图4所示。

图3 硫辛酸对谷氨酸菌体生长曲线的影响

图4 硫辛酸对谷氨酸质量浓度的影响

由图3可知:在发酵培养基中添加不同质量分数的硫辛酸,发酵前期菌体的生长曲线变化不明显,表明硫辛酸对前期谷氨酸菌体生长阶段的影响不明显;与硫辛酸0添加量相比,添加量为10 mg/kg和20 mg/kg时,发酵中后期菌体OD值变化不明显;当添加量增加到30 mg/kg时,发酵中期菌体OD值明显变大,后期菌体OD值的下降速度明显放缓;当添加量达到50 mg/kg时,OD值与添加量为30 mg/kg时基本一致,表明进一步加大添加量不会提高菌体OD值。由图4可知:随着硫辛酸添加质量分数的增加,谷氨酸质量浓度逐渐提高,当添加量达到30 mg/kg时,谷氨酸产酸率达到16.9 g/dL,与硫辛酸0添加相比,产酸率提高0.7 g/dL;当添加量继续加大时,谷氨酸质量浓度保持稳定,过量的硫辛酸对进一步提高菌体的产酸能力效果不明显。综上所述,发酵培养基中添加一定量的硫辛酸,发酵中后期菌体OD值明显升高,表明添加一定量的硫辛酸可降低菌体老化速度,提高谷氨酸的质量浓度,硫辛酸适合的添加量为30 mg/kg,此时的谷氨酸质量浓度为16.9 g/dL。

4.3 组合添加茶多酚和硫辛酸对谷氨酸发酵的影响

硫辛酸有很强的抗氧化作用,具有水溶性和脂溶性双重特性[23],可同时在细胞的亲水部分和脂质部分发挥抗氧化功效,作用时间也比其他抗氧化剂持久,硫辛酸在细胞体内转化为还原型的二氢硫辛酸[27],二氢硫辛酸和硫辛酸是防止细胞DNA损伤的有效保护剂[24],二氢硫辛酸还可以激活生物体内其他抗氧化剂的代谢循环。有研究表明硫辛酸与其他抗氧化剂复合使用比单独使用效果好[28]。依据前期实验结果,将20,10 mg/kg的茶多酚分别与30,20,10 mg/kg的硫辛酸进行组合,如表1所示。将组合1～6分别添加到发酵培养基中,与发酵培养基中茶多酚和硫辛酸0添加进行平行实验,组合添加后发酵后期谷氨酸菌体破碎情况如图5所示,对谷氨酸的质量浓度和糖酸转率的影响情况如图6所示。

表1 茶多酚与硫辛酸组合

图5 发酵后期谷氨酸棒杆菌镜检情况(放大1万倍)

图6 组合添加茶多酚和硫辛酸对谷氨酸质量浓度、糖酸转化率的影响

由图5可知:组合添加茶多酚和硫辛酸后,镜检观察到发酵后期谷氨酸菌体破碎情况减少,表明发酵菌体细胞得到了抗氧化剂的保护,延缓了细胞的衰老、减少了细胞破碎和自溶现象的发生。由图6可知:组合添加茶多酚和硫辛酸到发酵培养基中后,谷氨酸质量浓度和糖酸转化率明显提高;与茶多酚和硫辛酸0添加相比,组合添加20 mg/kg的茶多酚和10 mg/kg的硫辛酸时,谷氨酸质量浓度由16.2 g/dL提高到17.1 g/dL,糖酸转化率由64.6%提高到65.9%,指标值最好,明显优于单独添加茶多酚和硫辛酸的指标值。实验结果表明:发酵培养基中组合添加20 mg/kg的茶多酚和10 mg/kg的硫辛酸,比单独添加茶多酚和硫辛酸更加有利于提高谷氨酸质量浓度和糖酸转化率。

5 结 论

在谷氨酸发酵过程中,谷氨酸菌体进入产酸期后,加大通风量可以提升菌体活力以提高菌体产酸能力。然而菌体代谢和老化速度也随之加快,高产酸期持续时间缩短。笔者在发酵培养基中添加抗氧化剂茶多酚和硫辛酸,利用茶多酚和硫辛酸能够清除自由基的特性和硫辛酸的辅酶特性,阻断和减少自由基对菌体细胞造成的伤害,延缓菌体细胞的老化,减少了菌体破碎和自溶现象,提高谷氨酸菌体持续高产酸能力。组合添加20 mg/kg茶多酚和10 mg/kg硫辛酸时谷氨酸发酵质量浓度提高到17.1 g/dL,糖酸转化率提高到65.9%,对提高谷氨酸质量浓度和糖酸转化率效果最明显。