补骨颗粒含药血清对体外成管实验影响的研究＊

余光书 林焱斌 庄福毅 吴春玲

血管在骨组织的修复过程起着重要作用，如果新血管形成不足可能会造成氧气和营养供应不足，从而导致骨组织修复的失败[1]。新血管的再生多为内皮祖细胞（EPCs）分化为内皮细胞后再逐渐形成血管的过程，并且EPCs可以通过分泌多种细胞因子或生物活性物质参与这个过程[2-3]。因此，通过激活EPCs的活性及通过调控相关细胞因子分泌对于骨组织的修复具有重要意义。本研究结合既往使用补肾活血中药“补骨颗粒”对骨组织损伤修复的良好效果，拟应用补骨颗粒含药血清干预EPCs，通过体外观察成管实验及血管内皮生长因子（VEGF）的表达，以期为进一步研究补骨颗粒对骨组织损伤修复的机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 含药血清的制备

补骨颗粒中药组成：骨碎补20 g，鹿衔草12 g，淫羊藿12 g，潞党参15 g，茯苓20 g，三七3 g，川牛膝9g，当归9 g，川芎6 g，女贞子15 g，枸杞9 g，生地黄15 g，甘草3 g。补骨颗粒剂由厦门大学附属福州第二医院药剂科负责加工制备，每克颗粒药含原生药9.8 g，使用时用生理盐水加热溶解。

将成年SD大鼠（购于中南大学湘雅二医院，编号：430727201101351783）按照随机对照表分为空白对照组（10只）和实验组（10只），依据临床常用量按实验动物与人体表面积折算的等效剂量比值换算，将补骨颗粒用生理盐水加热溶解，制成1 g/ml的水溶液。空白对照组予生理盐水2 ml/kg灌胃，实验组予3.08 g/kg灌胃，1次/d，连续14 d，末次给药后2 h处死大鼠，并在无菌条件下采腹主动脉血5 ml，静置2 h，低温1 000 g离心15 min后分离血清，于56 ℃恒温水浴灭活30 min，-80 ℃冰箱保存。

1.2 骨髓EPCs分离及培养

取10周龄的雄性SD大鼠（购于中南大学湘雅二医院，编号：1107272011004991），经3%戊巴比妥钠（上海上药新亚药业有限公司；国药准字H31021724；规格：1 ml∶100 g）腹腔注射麻醉成功后分离出大鼠四肢，剔除周围肌肉组织，然后在无菌平皿中剪开股骨两端，使用10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培养基（SIGMA；货号：D5796-500ML）反复冲洗髓腔，将所得的细胞悬液过200目细胞滤网，400g离心5 min收集细胞。然后缓慢加入到Percoll分离液的离心管中以500g离心30 min，吸取中间乳白色云雾状有核细胞层，PBS冲洗3次后以400g离心10 min，将所得细胞用10%FBS的DMEM高糖培养基重悬，反复吹打制成单细胞悬液后接种于中号培养瓶，置于37 ℃含5%的CO2饱和湿度培养箱培养24 h后收集未贴壁细胞，换用EBM-2培养基接种于纤维粘连蛋白（FN）包被的培养皿中，于37 ℃含5%的CO2饱和湿度培养箱中培养3 d后首次换液，以后每3天换液1次。细胞密度达到70%～80%融合后用含质量百分比为0.125%胰酶及0.05%乙二胺四乙酸的消化液进行消化，按1∶4传代培养。

1.3 流式细胞学鉴定细胞表面抗原

将上述细胞传代培养至14 d时，用0.25%胰酶消化细胞，制备细胞悬液，350g离心5 min，收集细胞，0.5%BSA-PBS洗细胞2次。应用100 μl 0.5%的BSA-PBS重悬细胞沉淀，然后各管分别加入2 μl CD34-FITC抗体（Bioss；货号：bs-0646RFITC）、1 μl CD133-FITC抗体（Bioss；货号：bs-0395r-FITC）和1 μl VEGFR2-FITC抗体（Bioss；货号：bs-0565r-FITC），同时设置不染抗体管，37 ℃避光孵育30 min；应用0.5%的BSA-PBS洗细胞2次，350g离心5 min，再应用350 μl 0.5%的BSA-PBS重悬细胞，然后应用流式细胞仪（Beckman；型号：A00-1-1102）检测，使用cellquest pro软件进行分析检测。

1.4 补骨颗粒含药血清及空白血清对成管实验的影响

收集上述传代培养3代的EPCs，加入完全培养基，分别制备密度为2.0×104个/ml的细胞悬液，并按2 ml/孔的原则接种于48孔板中，将其置于37 ℃含5%的CO2饱和湿度培养箱培养，待每孔细胞汇合度达到50%～60%时，吸弃孔中原培养基并重新加入等体积的空白血清或补骨颗粒含药血清干预24 h。分别收集上述细胞用0.25%胰酶[含0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）]将细胞消化下来，制成细胞悬液，用细胞计数板计数，调整细胞密度，用培养基制成4×104个/孔的细胞悬液，然后加入48孔板中（每孔加入100 μl基质胶至均匀铺满孔）。于37 ℃孵育72 h时拍照观察成血管情况。

1.5 Elisa方法检测VEGF

在上述传代培养3代的EPCs完全培养基，分为空白血清组（n=5）及补骨颗粒含药血清组（n=5），加入等体积空白血清及补骨颗粒含药血清进行干预，分别于24、48及72 h时收集上述干预后的EPCs培养液作为检测样本。然后设空白孔、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μl，然后再加待测样品10 μl。每孔加入酶标试剂100 μl，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃温育60 min。将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。每孔先加入显色剂A 50 μl，再加入显色剂B 50 μl，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μl以终止反应。以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。

1.6 统计学处理

将Elisa方法检测的VEGF数值采用SPSS 18.0软件进行数据统计分析。两组同一时间点的对比采用配对样本t检验；同一指标组间两两比较采用单因素方差分析，当方差齐性时应用LSD方法检验，当方差不齐时应用Tamhane’sT2进行统计检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 细胞表型分析

将细胞传代培养至14 d时收集细胞，使用流式细胞检测仪检测提示CD34+细胞比例为70.03%，CD133+细胞比例为67.99%，血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2+）细胞比例为63.96%。

2.2 空白血清组与补骨颗粒含药血清组体外基质胶血管生成实验结果对比

空白血清组与补骨颗粒含药血清组细胞在半固体培养基中于24 h内呈索状生长，补骨颗粒含药血清组于72 h后细胞形态趋于典型，呈毛细血管腔样结构；而空白血清组未形成典型的毛细血管腔样结构，见图1。

2.3 空白血清组与补骨颗粒含药血清组VEGF表达量对比

补骨颗粒含药血清组在干预24 h时的VEGF表达量明显高于空白血清组（t=3.069，P=0.037），在干预48 h时的VEGF表达量也明显高于空白血清组（t=2.939，P=0.042）；但在干预72 h时补骨颗粒含药血清组与空白血清组VEGF表达量对比，差异无统计学意义（t=2.541，P=0.064）。补骨颗粒含药血清组在干预24、48、72 h时的VEGF表达量对比，差异无统计学意义（F=0.684，P=0.523），而空白血清组在干预24、48、72 h时的VEGF表达量明显升高（F=5.656，P=0.019），见表 1。

表1 空白血清组与补骨颗粒含药血清组VEGF表达量对比

3 讨论

血管新生是机体从已有的毛细血管网基础上，通过内皮细胞增殖、迁移和出芽方式形成新的毛细血管的过程，对于组织的修复起重要作用。由于EPCs具备自我更新和分化能力，在一定条件下可诱导分化为血管内皮细胞，所以近年通过研究EPCs在不同条件下对血管新生影响的研究也越来越多[4]。另外，自从研究者们发现血管EPCs在体外合适的培养条件下具有形成毛细血管样结构的能力，因此EPCs体外成血管实验由此被广泛应用于血管新生的研究[5]。本研究在此基础上，应用补骨颗粒含药血清对EPCs进行干预，通过成血管实验也发现内皮细胞具有形成毛细血管样结构的能力，并且这种能力在一定条件下受到补骨颗粒含药血清的促进作用。

EPCs是内皮细胞的前体细胞，其主要存在于脐带血、外周血及骨髓等，而骨髓内的EPCs在内源性或外源性刺激因素作用下分化为内皮细胞是参与血管新生的主要方式。本研究发现EPCs能够分化为内皮细胞且参与血管新生，这与目前研究发现EPCs能够促进血管网的形成从而促进骨组织的形成一致[6]。但是，目前对于其促进血管新生的方式仍存在一定的争议。比如有研究认为EPCs主要通过直接分化为内皮细胞而参与血管新生，也有研究认为其主要通过细胞因子影响血管的新生[7]。而机体中的血管新生受全身性和局部产生的信号的影响，本研究没有进一步从体内分开研究细胞因子对局部血管新生的影响，这对于讨论EPCs促进血管新生的机制存在一定的不足，今后可进一步从EPCs对体内血管新生的影响及局部细胞因子干预后血管新生情况进行研究。

VEGF是一种分子量在3 445 kDa的分泌性二聚体糖蛋白，对内皮细胞具有促进分裂和抗凋亡作用，还可增加血管通透性，促进细胞迁移，对血管生成过程中起积极作用，对EPCs的生长也存在重要作用[8]。而VEGF的生物学效应主要通过与VEGFR结合，从而激活细胞膜激酶级联反应信号并将其传递到细胞核，引起细胞内蛋白质表达的改变而影响血管通透性，并最终形成新生血管[9]。目前，大量文献已报道了通过持续提供VEGF或保持较高浓度的VEGF，将会促进血管的新生及骨组织的增生[10-11]。但是，VEGF的半衰期较短，容易在机体内扩散水解，从而导致单位体积内的VEGF浓度降低而影响其生物学效应[12]。因此，通过基因技术或外源性刺激因素提高VEGF表达量将是目前研究的重点[9，13]。本研究结合既往补骨颗粒对骨组织损伤修复具有良好效果的基础上，通过应用补骨颗粒含药血清干预EPCs后也发现其对VEGF表达具有一定影响，这对进一步了解补骨颗粒对骨组织的修复影响具有重要意义。由于本研究并未进一步探讨补骨颗粒对VEGF表达影响的具体机制，这对于研究存在一定的不足。但是，补骨颗粒主要由补肾活血中药组成，既往研究发现其具有改善局部氧含量及激活细胞活性的作用[14]。因此今后可以从补骨颗粒对氧浓度及缺氧诱导因子-α（HIF-α）信号途径的影响来探讨VEGF表达的动力学机制。

本研究通过应用补骨颗粒含药血清干预EPCs后发现补骨颗粒含药血清可以激活EPCs的活性，促进VEGF表达，从而增强EPCs的血管生成作用，这为进一步研究补骨颗粒对骨组织损伤修复的机制提供有效理论依据。