circPDE4B调控miR-7对骨关节炎中软骨ECM降解和细胞凋亡的影响

范金柱，任小宇，从飞，宋涛，郭云山，马强

(1.西安交通大学附属红会医院骨显微修复外科，陕西 西安 710054；2.西安交通大学附属红会医院脊柱外科，陕西 西安 710054；3.西安交通大学附属红会医院足踝外科，陕西 西安 710054)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种慢性疼痛性关节炎，是患者残疾的主要原因，全球至少有2.42亿人患有髋/膝OA[1]。此外，随着人口老龄化和肥胖等危险因素的增加，OA的发病率也呈上升趋势[2]。OA的发病机制复杂，主要由机械、遗传、代谢和炎症等途径参与的慢性演变过程[3]。目前，OA的治疗主要通过药物治疗，部分患者需要考虑进行关节置换手术。药物治疗主要采用非甾体抗炎药和阿片类药物等，通过药物控制疼痛和改善患者的症状[4]，然而OA患者的预后并不理想[5]。circRNAs是ncRNA的一个特殊子集，具有共价闭环结构，既没有5′-3′极性也没有多聚腺苷酸尾[6]。研究显示circRNAs参与了真核生物的多种生理和病理过程，如癌症进展、炎症、衰老和感染等[7]。近年来，OA与circRNAs之间的关系得到了部分阐明，circRNAs可能通过干扰软骨细胞增殖和凋亡、调节细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)降解和炎症等途径参与OA的发生及发展[8]。研究显示circPDE4B在OA患者软骨组织中显著低表达，并能够通过调控RIC8A和MID1参与OA的进展，然而其进一步的生物学功能未完全明确[9]。因此，本研究选取2019年3月至2020年10月在西安交通大学附属红会医院住院治疗的28例OA患者，检测circPDE4B的表达水平，并在细胞水平验证circPDE4B对OA软骨细胞ECM降解和凋亡的影响及机制。

1 材料和方法

1.1 组织标本 选取2019年3月至2020年10月在西安交通大学附属红会医院住院治疗的28例OA患者和28例半月板损伤患者。OA患者男性16例，女性12例；年龄30～80岁，平均年龄(64.1±13.7)岁。半月板损伤患者男性18例，女性10例；年龄18～80岁，平均年龄(35.5±11.8)岁。OA患者行全膝关节置换术；半月板损伤患者行膝关节镜下半月板成形术，切除损伤部分半月板。采用美国风湿学院标准诊断OA，所有患者均未患有痛风性关节炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎和继发性骨关节炎等。在术中切除软骨组织，标本分成相同大小并保存于液氮中。所有患者术前签署知情同意书。

1.2 主要试剂 DMEM/F12培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；细胞凋亡试剂盒购自上海弗元生物科技有限公司；RT-qPCR试剂盒和TRIZol试剂购自日本TaKaRa公司；Cleaved-caspase-3、SOX9、COL2A1、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)3、MMP13和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体购自美国Sigma-Aldrich公司；lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；转染所需质粒由中国上海吉凯基因有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养与转染 人软骨细胞通过两步酶消化法进行分离，传代至第3代用于后续实验。采用含10%胎牛血清的DMEM/F12细胞培养基在37 ℃、5% CO2平衡湿度培养箱中培养。采用Lipofectamine 2000转染质粒至OA软骨细胞。

1.3.2 RT-qPCR 按照Trizol试剂说明书提取组织和细胞中总RNA，采用Nano-Drop2000检测RNA浓度。逆转录合成cDNA后，采用SYBR Green RT-qPCR检测circPDE4B、miR-7、SOX9、COL2A1、MMP3、MMP13的表达水平。以GAPDH或U6作为内参，采用2-△△Ct法计算相对表达量。

1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡 收集转染48h后的OA软骨细胞，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)清洗2次后重悬，按照说明加入Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂和染色液碘化丙啶(propidium iodide，PI)在室温下避光10min，采用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。

1.3.4 免疫蛋白印迹(western blot，WB) 采用ripa裂解液提取细胞中总的蛋白，使用聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate，BCA)试剂盒测定蛋白浓度。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离蛋白后转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜，在室温条件下5%脱脂奶粉封闭，加入一抗Cleaved-caspase-3、SOX9、COL2A1、MMP3、MMP13和GAPDH后，在4℃下孵育过夜，次日加入二抗孵育2h，电化学发光(electro-chemi luminescence，ECL)显影并检测灰度值。

1.3.5 荧光素酶报告基因检测 将野生型(WT)或突变型(MUT)circPDE4B克隆到pmirGLO质粒受体中，同时将miR-NC或miR-7 mimics导入OA软骨细胞中，共培养48 h后采用双荧光素酶受体分析系统测量双荧光素活性。

2 结 果

2.1 OA软骨组织和软骨细胞中circPDE4B的表达水平 半月板损伤患者和OA患者软骨组织的番红O染色显示在OA患者中软骨组织存在明显病变(见图1a～b)。进一步检测OA软骨组织和软骨细胞中circPDE4B的表达水平，结果显示circPDE4B的表达水平在OA软骨组织中明显低于半月板损伤患者软骨组织(见图2a，P<0.05)。进一步分离软骨细胞，OA软骨细胞中circPDE4B的表达水平明显低于正常软骨细胞(见图2b，P<0.05)。细胞功能验证中，在OA软骨细胞中分别转染oe-NC和oe-circPDE4B，结果显示转染oe-circPDE4B后，circPDE4B的表达水平明显高于转染oe-NC(见图2c，P<0.05)。

a 半月板损伤患者软骨组织完整 b OA患者软骨组织明显破坏

2.2 过表达circPDE4B对OA软骨细胞凋亡的影响 在circPDE4B对OA软骨细胞生物学功能的研究中，流式结果显示过表达circPDE4B能够明显抑制OA软骨细胞的凋亡(见图3a，P<0.05)，同时抑制凋亡相关分子Cleaved-caspase-3蛋白的表达水平(见图3b，P<0.05)。

a 流式细胞术检测细胞凋亡情况 b WB检测Cleaved-caspase-3蛋白的表达水平

2.3 过表达circPDE4B对OA软骨ECM降解的影响 为分析circPDE4B对OA软骨ECM降解的影响，在OA软骨细胞中分别转染oe-NC和oe-circPDE4B后检测ECM相关分子SOX9、COL2A1、MMP3和MMP13的表达水平。RT-qPCR结果显示，过表达circPDE4B明显促进SOX9和COL2A1 mRNA的表达水平，抑制MMP3和MMP13 mRNA的表达水平(图4a，P<0.05)。WB结果显示，过表达circPDE4B明显促进SOX9和COL2A1蛋白的表达水平，抑制MMP3和MMP13蛋白的表达水平(图4b，P<0.05)。

a RT-qPCR检测ECM相关分子mRNA的表达水平 b WB检测ECM相关分子蛋白的表达水平

2.4 circPDE4B能够靶向结合miR-7 在机制研究中，双荧光素酶基因报告结果显示circPDE4B-WT组中转染miR-7 mimics后双荧光素活性明显下降(见图5a，P<0.05)，在circPDE4B-MUT组中转染miR-7 mimics后双荧光素活性未见明显改变(见图5a，P>0.05)。过表达circPDE4B能够明显抑制OA软骨细胞中miR-7的表达水平(见图5b，P<0.05)。miR-7的表达水平在OA软骨组织中明显高于半月板损伤患者软骨组织(见图5c，P<0.05)，Pearson相关性分析显示circPDE4B和miR-7在OA患者软骨组织中的表达水平呈负相关(见图5d，P<0.05)。

a 双荧光素酶基因报告 b RT-qPCR检测miR-7的表达水平 c OA软骨组织和半月板损伤软骨组织 d circPDE4B和miR-7的表达相关性

2.5 circPDE4B调控miR-7对OA软骨细胞凋亡的影响 在回复实验中，OA软骨细胞中分别转染si-NC、si-circPDE4B和共转染si-circPDE4B+miR-7 inhibitors，结果显示低表达circPDE4B能够明显促进OA软骨细胞的凋亡(见图6a，P<0.05)，同时促进凋亡相关分子Cleaved-caspase-3蛋白的表达水平(见图6b，P<0.05)。共转染si-circPDE4B和miR-7 inhibitors能够反转单独转染si-circPDE4B对OA软骨细胞凋亡的影响(见图6，P>0.05)。

a 流式细胞术检测细胞凋亡情况

2.6 circPDE4B调控miR-7对OA软骨细胞ECM降解的影响 低表达circPDE4B能够明显抑制SOX9和COL2A1 mRNA的表达水平，促进MMP3和MMP13 mRNA的表达水平(见图7a，P<0.05)。WB结果显示低表达circPDE4B能够明显抑制SOX9和COL2A1蛋白的表达水平，促进MMP3和MMP13蛋白的表达水平(见图7b，P<0.05)。共转染si-circPDE4B和miR-7inhibitors能够反转单独转染si-circPDE4B对OA软骨细胞ECM降解的影响(见图7，P>0.05)。

a RT-qPCR检测ECM相关分子mRNA的表达水平 b WB检测ECM相关分子蛋白的表达水平

3 讨 论

OA的典型病理改变包括软骨破坏、骨赘形成和滑膜增生[10]。OA主要特征是基质降解酶的上调，包括属于金属蛋白酶家族、含有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)以及细胞外间质的丢失[11]。研究显示circRNA-UBE2G1能够通过调控miR-373/低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α轴抑制OA软骨细胞活性和促进软骨细胞凋亡[12]。circRNA-CER能够调控miR-136/MMP-13轴抑制OA软骨细胞增殖和促进软骨细胞凋亡[12]。circRNA-CER能够调控miR-136/MMP-13轴促进OA软骨ECM降解[13]。circ9119在OA软骨细胞中明显低表达，过表达circ9119能够通过miR-26a/人第10号染色体缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)轴抑制OA软骨细胞的凋亡[14]。然而，circRNAs在OA中的作用还有待进一步研究。

本研究结果显示circPDE4B的表达水平在OA软骨组织和软骨细胞中明显低表达。细胞功能验证中，在OA软骨细胞中分别转染oe-NC和oe-circPDE4B，转染oe-circPDE4B后能够明显提高circPDE4B在软骨细胞中的表达水平。过表达circPDE4B能够明显抑制OA软骨细胞的凋亡和凋亡相关分子Cleaved-caspase-3蛋白的表达水平。ECM主要由胶原蛋白(例如Ⅱ、IX和XI型胶原)、糖蛋白和大量蛋白聚糖组成。ECM的降解和OA的发病密切相关，在OA中可表现出ECM相关分子SOX9和COL2A1的下调以及MMP3和MMP13的上调[15]。本研究结果显示过表达circPDE4B能够明显促进SOX9和COL2A1的表达水平，抑制MMP3和MMP13的表达水平，这提示circPDE4B能够抑制OA软骨细胞的凋亡和ECM降解。研究显示多种非编码RNA能够通过调控ECM降解参与心肺纤维化、心肌病、心力衰竭、哮喘、OA和癌症等疾病[16]。

在机制研究中，circRNA最常见的功能为miRNA海绵吸附作用。研究显示circSERPINE2在OA中明显下调，低表达circSERPINE2能够促进OA软骨细胞凋亡和ECM的降解[17]。本研究结果显示circPDE4B能够靶向结合miR-7，过表达circPDE4B能够明显抑制OA软骨细胞中miR-7的表达水平。同时miR-7的表达水平在OA软骨组织中明显高于半月板损伤患者软骨组织，Pearson相关系分析显示circPDE4B和miR-7在OA患者软骨组织中的表达水平呈负相关。这提示circPDE4B可能通过靶向调控miR-7参与OA的进展。研究显示miR-7在OA中明显高表达，低表达miR-7能够抑制OA软骨细胞的凋亡和炎症，促进OA软骨细胞的增殖[18]。同时circPDE4B还能够通过调控miR-181c/HIF-1α轴抑制视网膜病理性血管生成[19]。

在回复实验中，OA软骨细胞中分别转染si-NC、si-circPDE4B和共转染si-circPDE4B+miR-7 inhibitors，结果显示低表达circPDE4B能够明显促进OA软骨细胞的凋亡和软骨ECM的降解，在共转染si-circPDE4B和miR-7 inhibitors能够反转单独转染si-circPDE4B对OA软骨细胞凋亡和软骨ECM降解的促进作用。研究显示circPDE4B还能通过调控miR-103a-3p/成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)18轴抑制OA软骨ECM降解[20]。

综上所述，circPDE4B在OA软骨组织和软骨细胞中明显低表达，circPDE4B能够通过靶向结合miR-7抑制OA软骨细胞凋亡和软骨ECM降解。circPDE4B可能成为治疗OA的重要干预靶点。