虎杖治疗肺动脉高压作用机制的网络药理学研究*

余志杰，陈 兴，左建丽，何 瑶，郑姣妮，郑晓媛

（重庆市第四人民医院·重庆市急救医疗中心药剂科，重庆 400014）

肺动脉高压（PAH）是由于肺血管狭窄或阻力增加引起的肺动脉压力异常增高的慢性疾病，具有肺血管重构和肺血管阻力增加的显著病理特征，后期可发展为右心衰竭甚至死亡［1］。PAH 的发病机制涉及多种因素，主要包括遗传变异、血管细胞的异常增殖、代谢障碍、炎性及免疫反应［2-4］。与预后不良程度相关的因素包括性别、年龄、PAH 分级、右心室功能障碍相关指标、结缔组织病等。约50%患者死于右心衰竭引起的循环衰竭。PAH 特异性治疗药物包括前列环素通路激动剂、内皮素受体拮抗剂、一氧化氮- 环磷酸鸟苷增强剂及钙通道阻滞剂（少用）［5-6］，但这些药物的运用均缺乏大型、多中心临床试验支持。虎杖为蓼科植物虎杖Polygo⁃num cuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根和茎，具有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰功效，主要用于湿热黄疸、风湿痹痛、肺热咳嗽等的治疗［7］。虎杖药材具有广泛的生物活性，包括抗炎、抗病毒、调血脂、抗肿瘤、抗氧化、扩血管等［8］。研究证实虎杖的活性成分白藜芦醇和虎杖苷对PAH 模型大鼠均具有保护作用。白藜芦醇主要通过MAPK/ERK1 及PI3K/AKT 信号通路发挥抗炎抗血管异常增生作用，而虎杖苷对PAH 的作用机制研究较缺乏［9-10］。前期研究发现，虎杖提取物及其活性成分虎杖苷可改善高脂饮食诱导的动脉粥样硬化及抑制血管平滑肌细胞增殖［11］。网络药理学基于中药多成分- 多靶点- 多途径思维，研究中药或复方治疗疾病的物质基础及潜在作用靶点和机制，对阐明中医药理论“整体观”的思想提供了重要借鉴［12-13］。本研究中基于该方法探讨了虎杖药材治疗PAH 的潜在活性成分及作用机制，利用分子对接技术验证虎杖药材中活性成分与作用靶点的结合性能，从而为开展虎杖药材治疗PAH 具体作用机制的体内体外实验提供科学依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 潜在治疗靶点获得

利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP），以“虎杖”为关键词搜索其活性成分，将口服生物利用度（OB）及类药性（DL）作为筛选参数，设OB > 30%，DL>0.18，筛选并构建活性成分库，并检索PubMed数据库收集已证实的虎杖相关活性成分，共同纳入该库。再利用TCMSP 数据库获取虎杖活性成分的潜在靶点，并通过Uniprot 数据库将靶点蛋白名称标准化，选择物种“Homo sapiens”（下同），转换为对应的基因名称，即得虎杖活性成分化合物库的潜在作用靶点基因。

利用人类基因数据库（GeneCards）、人类孟德尔遗传数据库（OMIM）以Relevance score ≥5.0为筛选条件。筛选PAH 相关致病靶点，搜索英文关键词“Pulmonary hypertension”“Pulmonary arterial hypertension”，得到与PAH相关的靶点。

取GeneCards，OMIM 及虎杖活性化合物靶点的交集，获得虎杖活性化合物治疗PAH的潜在靶点。

1.2 网络构建

将1.1 项结果导入Cytoscape 3.7.1 软件构建药物（虎杖）- 活性成分- 靶点网络关系图；节点（Node）代表中药、潜在活性成分及靶点，边（Edge）代表节点间的相互联系，节点度（Degree）值越大，节点越重要；通过String 数据库获取靶点的蛋白-蛋白相互作用（PPI）关系，再通过Cytoscape 3.7.1 软件的Network analysis功能进行网络拓扑学分析，并通过靶点的节点度值构建PPI网络。

1.3 目标基因富集分析

利用DAVID 数据库分析挖掘虎杖活性成分潜在作用靶点的生物注释功能信息，进行基因本体论（GO）富集分析，包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）3个部分。将虎杖活性成分对PAH的潜在作用靶点导入Functional annotation中，在结果中选择并导出GO富集分析中的BP，CC，MF，设定错误发现率（FDR）<0.05且P<0.01，筛选虎杖活性成分作用靶点显著富集的主要功能注释及体内通路，将排名靠前的富集结果可视化绘制为条形图；利用Metascape 数据库中的基因富集分析工具，将虎杖活性成分作用靶点的Uniprot ID导入其中，进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，获取虎杖治疗PAH的作用通路，以FDR<0.05且P<0.01为筛选条件，并可视化排名前20的信号通路。

1.4 分子对接

利用PubChem 数据库下载节点度值排名靠前的活性成分槲皮素、白藜芦醇、囊毒碱、木犀草素、大黄素、芹黄素、虎杖苷的3D 结构，利用RCSB PDB 蛋白数据库下 载 核心靶点AKT1，VEGFA，TNF，MAPK3，TP53，EGFR（蛋白质ID 分别为6HHG，1BJ1，1A8M，2ZOQ，4KVP，4KRM）的3D 结构。利用AutoDock Tools 1.5.6 软件进行分子对接获取最佳结合能，结果用PyMOL 软件进行可视化分析。

2 结果

2.1 潜在治疗靶点

共得虎杖活性成分39 种，详见表1。并据此得到对应的潜在靶点，去重后通过标准化转换，得虎杖有效成分的靶基因共323个。

表1 虎杖活性成分Tab.1 The active components of Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix

经GeneCards 数据库筛选得2 874 个靶基因，经OMIM数据库筛选得5 343个靶基因。

将上述靶基因与虎杖活性化合物靶点取交集，得虎杖活性化合物治疗PAH 的潜在靶点138 个。详见图1。

图1 潜在靶点Fig.1 Potential targets

2.2 网络构建

2.2.1 药物-活性成分-疾病靶点网络

共得178 个节点，其中1 个中药节点，39 个化合物节点，138 个靶点节点，共2 356 条边。靶基因中节点度值排名靠前的为AKT1，PTGS2，TNF，VEGFA，TP53，MAPK8，EGF，CASP3，MAPK3，EGFR 等，而活性成分槲皮素、白藜芦醇与靶基因的连接数均超过68，可能为虎杖改善PAH 的主要核心成分。此外，虎杖的不同活性成分可作用于同一靶点，而同一活性成分又可作用于不同靶点，体现出虎杖治疗PAH 多成分- 多靶点的协同作用特点。详见图2。

图2 药物-活性成分-疾病靶点网络关系图Fig.2 PPI network of traditional Chinese medicines-active components-disease targets

2.2.2 PPI 网络

138 个靶蛋白间的PPI 网络，节点颜色越红表示节点的节点度值越高，靶点重要性越大，见图3。节点度值> 60 且 排 名 前23 的 靶 点 为AKT1，VEGFA，TNF，MAPK3，TP53，EGFR，MAPK8，CASP3，PTGS2，MAPK1，STAT3，MYC，MMP9，EGF，IL-1β，CCL2，IL-10，MMP2，ESR1，FGF2，PPARG，PTEN，ERBB2。详见表2。

表2 节点度值排名前23的核心靶点Tab.2 The top 23 key targets with degree value

图3 PPI网络图Fig.3 PPI network

2.3 GO 功能富集分析与KEGG 通路富集分析

共富集到16 条BP，15 项CC，15 项MF，见图4。其中BP 主要富集在基因表达的正调控、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、对脂多糖的反应等；CC主要富集在细胞间隙、质膜、胞外区、线粒体等；MF 主要富集在细胞因子活性、转录因子结合、生长因子活性等。

P值排名前20 的信号通路见图5，靶点主要富集在PI3K/AKT 信号通路、TNF 信号通路、MAPK 信号通路、HIF - 1 信号通路、FOXO 信号通路及凋亡相关信号通路，上述通路分别涉及细胞的增殖生存调控、炎性反应、细胞周期、凋亡及自噬等在低氧刺激下HIF-1信号通路的激活与PAH 的发病机制相关。KEGG 信号通路见图6。

图5 KEGG通路富集分析结果Fig.5 The results of KEGG pathway enrichment analysis

图6 KEGG信号通路图Fig.6 KEGG signaling pathway

2.4 分子对接

虎杖活性成分（槲皮素、白藜芦醇、囊毒碱、木犀草素、大黄素、芹黄素、虎杖苷）与核心靶点（AKT1，VEGFA，TNF，MAPK3，TP53，EGFR）的对接结果见表3。7个活性成分结合AKT1 所需的能量总体较低，因此推测虎杖的活性成分可能主要作用于AKT1。此外，大黄素、芹黄素与TNF 的结合能，白藜芦醇、木犀草素与AKT1 的结合能均较低，表现出良好的亲和力。其具体的分子对接模式见图7（绿色：配体；黄色：氨基酸残基；虚线：氢键）。

表3 活性成分与核心靶点分子对接结果Tab.3 Results of molecular docking between active components and key targets

3 讨论

网络药理学是基于系统生物学理论，通过构建药物、基因、疾病相互间作用的网络关系，从节点和靶点间的相互作用强度探究药物潜在作用机制和药物设计的一门新兴学科［14］。网络药理学不仅揭示了中药治疗疾病的潜在活性成分和具体的作用靶点，而且可为阐明中医药治疗疾病的多成分-多靶点-多途径的作用特点提供重要的研究方法［15］。本研究结果表明，虎杖的关键活性成分（大黄素、芹黄素、白藜芦醇、木犀草素）主要靶向AKT1、TNF 等靶点，调控PI3K/ AKT、TNF、MAPK 等信号通路，通过影响细胞增殖、凋亡、炎性反应等生物过程，从而改善PAH。

通过“药物- 活性成分- 靶点”网络关系图可知，AKT1，PTGS2，TNF，VEGFA，TP53，MAPK8，EGF，CASP3，MAPK3，EGFR 靶点与活性成分连接数较高，同时PPI网络关系图也证实了AKT1，TNF，MAPK3，VEGFA，TP53，EGFR 为核心靶点，表明虎杖的活性成分可能主要靶向上述靶点发挥抗PAH 的作用。GO 功能富集分析结果显示，其BP主要富集在基因表达的正调控、炎性反应、调节血管生成、缺氧反应、细胞增殖及凋亡过程。有研究已证实，AKT1 经PI3K 的磷酸化而激活，主要参与PI3K/ AKT 信号通路调节细胞增殖与生存［16］。同时TNF，MAPK3 引起的炎性反应在PAH 的发生机制中也被证实［17-18］。在血管内皮细胞的体外实验中也发现VEGFA 和EGFR 的异常表达与PAH 密切相关［19-20］。FENG 等［21］的研究结果显示，TP53 可调控人肺动脉平滑肌细胞（HPASMC）的细胞周期及凋亡从而抑制PAH。此外，KEGG 通路富集分析结果也显示，虎杖主要通过PI3K/AKT 信号通路、TNF 信号通路、MAPK 信号通路、HIF - 1 信号通路、FOXO 信号通路及凋亡相关信号通路影响PAH，上述多条信号通路相互影响，如TNF 可激活下游的NF - κB、MAPK 信号通路，促进炎性因子表达，从而导致炎性反应。ZHU 等［22］的研究结果表明，在野百合碱诱导的PAH 模型大鼠中MAPK/NF-κB信号通路被明显激活。同时，PI3K/AKT 信号通路不仅能促进平滑肌细胞增殖导致肺血管重构，而且也能调控下游NF - κB 信号通路介导的炎性反应。此外，TGF 作用于EGFR受体可诱导下游细胞增殖基因FOS，MYC，JUN的表达，从而上调VEGF 及MMPs 的表达引发血管的增生和重构。研究证实，低氧可诱导HPASMC上调HIF-1α表达，激活HIF - 1 信号通路，导致EGF/VEGF 的异常表达［23］。同时，VEGF 也可作用于VEGFR2受体激活PI3K/ AKT 信号通路，抑制CASP9 和Bcl - 2 的表达从而诱导凋亡，并且EGF与其受体结合可激活FOXO信号通路从而影响细胞周期。

A.BP B.CC C.MF图4 GO功能富集分析结果A.Biological process（BP） B.Cellular composition（CC） C.Molecular function（MF）Fig.4 The results of GO function enrichment analysis

A.大黄素+ TNF B.芹黄素+ TNF C.白藜芦醇+ AKT1 D.木犀草素+ AKT1图7 分子对接中结合能较低的结果A.Emodin+TNF B.Apigenin+TNF C.Resveratrol+AKT1 D.Luteolin+AKT1Fig.7 The results with lower binding energy in molecular docking

为进一步证明虎杖活性成分与核心靶点结合的亲和力，通过分子对接技术验证槲皮素、白藜芦醇、囊毒碱、木犀草素、大黄素、芹黄素、虎杖苷与核心靶点AKT1，VEGFA，TNF，MAPK3，TP53，EGFR 的结合性能，结果表明，7 个活性成分均与6 个核心靶点表现出良好的结合能，结合能较低的为芹黄素与TNF（-6.96 kcal/mol），而且这些活性成分与AKT1 的亲和力优于其他靶点，证明虎杖的活性成分可能主要靶向AKT1，从而通过影响血管细胞的生长与增殖引起血管重构。本研究中选择的虎杖活性成分的不同点在于，还从PubMed 数据库中检索已证实的虎杖活性成分（如虎杖苷），共同纳入虎杖活性成分库，从而避免遗漏。此外，有研究已证实在低氧诱导的PAH 模型大鼠中，虎杖苷可通过调节一氧化氮、内皮素的含量改善PAH，但其具体作用机制仍需进一步研究［10］。因此，本课题组后期的体外实验会重点研究虎杖苷、槲皮素、白藜芦醇、囊毒碱、木犀草素、大黄素、芹黄素对低氧诱导肺动脉平滑肌细胞的影响，及其对AKT1 和VEGFA 靶点的调节作用，从而证实虎杖药材治疗PAH的具体活性物质和作用机制。

综上所述，本研究中通过网络药理学和分子对接技术预测虎杖药材防治PAH的潜在活性成分和核心靶点，为虎杖药材的临床应用提供了一定参考。