固态发酵葛根渣制备葛根素

张帅，罗静怡，唐婷范，程昊*，刘承耀

（1.肇庆学院食品与制药工程学院，广东 肇庆 526601；2.广西科技大学生物与化学工程学院，广西糖资源绿色加工重点实验室，广西柳州螺蛳粉工程技术研究中心，广西 柳州 545006；3.蔗糖产业省部共建协同创新中心，广西 南宁 530004；4.济南市第六人民医院/济宁医学院附属章丘区人民医院骨关节科，山东 济南 250200）

葛根（Radix puerariae）是多年生落叶藤本植物野葛或甘葛藤的块根[1]。野葛[Pueraria lobata（Willd.）O－hwi]和粉葛（P.thomsonii Benth.）是最具代表性的两种葛根，由于含有异黄酮和淀粉因而具有药食两用特性[2]。广东和广西主要分布的是粉葛，粉葛淀粉含量高，因而主要用于食品工业中葛粉的生产[3]。葛粉加工后会产生大量的副产物葛根渣，葛根渣通常是作为废弃物被填埋或焚烧，有时会用作花卉植物和食用菌的栽培料，利用价值很低且易造成环境污染[4-5]。

葛粉加工主要是将葛根淀粉提取出来，异黄酮损失很小，因而葛根渣中通常含有大量异黄酮[6]。葛根异黄酮的主要成分是葛根素，葛根素是大豆苷元的8-C-葡萄糖苷[7]，具有广泛的药理作用，如舒张血管、保护心脏和神经、抗氧化、抗炎症、止痛、促进骨形成、提高细胞免疫力、减轻胰岛素抵抗等，临床上已用于心脑血管疾病、糖尿病及并发症、骨坏死、帕金森、阿尔茨海默、子宫内膜异位及癌症的治疗[8-14]。

提取葛根素的常规方法是醇提法[15-17]。由于葛根细胞壁的纤维素及半纤维素组成的结晶结构能阻碍葛根素的有效溶出，因而醇提法虽然简单易行，但葛根素提取率较低[18-19]，目前仅限于实验室研究。为了破坏细胞壁的纤维结构，使葛根素易于溶出，先加入纤维素酶进行水解，然后再提取葛根素，可显著提高产品得率。然而纤维素酶目前价格还比较高，因此采用酶法提取葛根素生产成本较高，难以实现规模化工业生产。

本研究利用黑曲霉菌株固态发酵葛根渣高效制备葛根素。通过微生物自身酶系对植物细胞壁的酶解作用来增强细胞通透性，从而提高葛根素的提取率。将发酵产物用乙醇提取以获得葛根素粗提物，最后采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法检测粗提物中葛根素的含量。通过微生物发酵技术获得葛根素，生产成本低，产品得率高，发酵后的培养基残渣还可用作肥料，因而有望实现产业化。本研究对于促进我国葛根及相关产业的发展具有重要意义，也可为其他天然活性产物的高效制备提供方法参考和技术示范。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌种：黑曲霉，肇庆学院食品与制药工程学院食品微生物实验室4℃冰箱保藏；葛根渣：柳州市葛源贸易有限责任公司，105℃烘干至恒重后粉碎，过50目筛。粉末状葛根渣封袋备用。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）（粉末状商品）：广东环凯微生物科技有限公司，按说明书配好后分装试管，灭菌后做成PDA斜面若干，冷藏备用。

固态发酵培养基：葛根渣8.0g，麸皮3.0g（渣麸质量比8∶3），NH4NO30.85g，MnCl20.05g，MgSO4·7H2O0.005g，KH2PO40.005 g，水8.3 g（约占固体成分质量的70%）。

葛根素标准品（色谱纯）：成都埃法生物科技有限公司；甲醇（色谱纯）：上海安谱实验科技股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DGX-9143 B-1电热恒温鼓风干燥箱：上海福玛实验设备有限公司；HH-6数显恒温水浴箱：江苏金坛市环宇科学仪器厂；LC-2030高效液相色谱仪（配套SPD-10A紫外检测仪）：日本岛津公司；XB-10B高速多功能粉碎机：东莞市隆鑫机电设备有限公司；H-1850台式高速离心机：湘潭湘仪仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉菌悬液制备

将黑曲霉划线接种于PDA斜面，30℃培养72 h后斜面长满黑色孢子。无菌条件下，取1环孢子接入10 mL已灭菌的含0.1%吐温-80的0.85%生理盐水中摇匀，即得黑曲霉菌悬液。

1.3.2 固态发酵葛根渣

取250 mL锥形瓶若干，分别装入固态发酵培养基，灭菌后分别接入1 mL黑曲霉菌悬液，振荡锥形瓶使菌悬液尽量均匀分布于培养基中30℃发酵。不同锥形瓶分别发酵 24、48、72、96、120、144、168h，然后分别提取葛根素并测定发酵物料的木聚糖酶和CMC酶活力。

1.3.3 木聚糖酶和CMC酶活力测定

参考施英英等[20]的测定方法，一个木聚糖酶活力国际单位（IU）表示每分钟降解反应底物木聚糖释放1.0 μmol还原糖（以木糖计）所需的酶量；以羧甲基纤维素钠（sodium salt of caboxy methyl cellulose，CMCNa）作为底物测定CMC酶的活力，1个酶活力单位（U）定义为在50℃、pH4.8条件下每小时降解底物生成1.0 mg还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量。

1.3.4 葛根素提取

发酵结束后，取出一半发酵物料置于另一250 mL锥形瓶中，在两个发酵物料锥形瓶中各加入70%乙醇溶液100 mL，摇匀后置于80℃恒温水浴中提取180 min，期间每30 min振摇一次锥形瓶。最后将瓶内物料进行抽滤，滤液合并即为葛根素粗提液。

1.3.5 葛根素HPLC检测

1.3.5.1 样品预处理

将葛根素粗提液置于高速离心机中，10 000 r/min离心20 min后，收集上清液，共得170 mL。上清液经0.22 μm滤膜过滤后，进样高效液相色谱仪检测。

1.3.5.2 葛根素标准曲线的建立

先将葛根素标准品用30%乙醇溶液配制成浓度为1.0 mg/mL的葛根素标准品溶液，然后按0.001、0.010、0.200、0.400、0.600、0.800 mg/mL 的浓度梯度稀释。以葛根素标准品溶液浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标建立标准曲线。

1.3.5.3 色谱条件

色谱柱：Shim-pack VP-ODS型C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），流动相：甲醇-水（体积比 30∶70），检测波长250nm，流速1mL/min，进样量10μL，恒定柱温30℃。

1.3.5.4 发酵葛根渣所得葛根素含量的计算

求出样品色谱峰面积，代入葛根素标准曲线方程求出样品中葛根素浓度Cx，则发酵葛根渣所得葛根素含量：C1/（mg/g）=（170×Cx）/8.0。

1.3.6 葛根渣直接醇提葛根素及检测

称取葛根渣4.0 g置于250 mL锥形瓶中，加入70%乙醇溶液100 mL提取葛根素，操作方法同1.3.4。获得的葛根素粗提液按1.3.5.1预处理后共收集到75 mL。葛根素HPLC检测色谱条件同1.3.5.3。求出样品色谱峰面积，由葛根素标准曲线方程求出葛根素浓度Cy，则葛根渣直接醇提的葛根素含量：C2/（mg/g）=（75×Cy）/4.0。

2 结果与分析

2.1 葛根渣固态发酵产葛根素和产酶进程

葛根渣固态发酵不同时间产葛根素进程如图1所示，产酶（木聚糖酶和CMC酶）进程如图2所示。

图1 固态发酵葛根渣产葛根素进程Fig.1 Puerarin production process of solid state fermentation of Pueraria root residue

图2 固态发酵葛根渣产酶进程Fig.2 Enzyme production process of solid state fermentation of Pueraria root residue

木聚糖酶能够降解葛根细胞壁中的半纤维素[21]，而CMC酶则可以将细胞壁纤维素分解[22]，二者协同作用可进一步提高葛根细胞壁的通透性[3]，从而加速胞内葛根素的溶出。由图1和图2可知，产葛根素进程与产酶进程二者密切相关。发酵24 h时培养基内仅生成少量白色菌丝，此时产酶很低，对葛根细胞壁通透性的影响较小，因此测得的葛根素含量基本等同于直接醇提葛根渣获得的葛根素。随着发酵时间的延长，菌丝增加、孢子生成，酶活力迅速提升，葛根细胞壁通透性不断加强，葛根素含量亦不断提高。当发酵72 h时，培养基内已长满黑色孢子，CMC酶活力达到最高值1 274 U/g，发酵96 h时，木聚糖酶活力达到最高值8 825 IU/g，继续发酵，随着菌体的老化，酶活力逐渐下降。由于酶对细胞壁的降解破坏作用是累积的，因此葛根素含量达到最高值需要比酶活力达到最高值更长的发酵时间，当发酵至120 h时，葛根素含量已接近最大值，继续发酵，葛根素含量虽略有提高，但曲线已趋于平稳，说明葛根素已最大程度溶出。

2.2 葛根素HPLC检测结果

2.2.1 葛根素标准曲线

不同浓度的葛根素标准品溶液的HPLC图如图3所示。

图3 葛根素标准品溶液的HPLC图Fig.3 HPLC chart of puerarin standard solution

基于葛根素浓度和色谱峰面积建立的葛根素标准曲线方程：y=46 053 070.57x-25 078.99，校正系数R2=0.999 86，表明方程线性拟合良好。

2.2.2 葛根渣中葛根素含量

固态发酵葛根渣120 h后，发酵物料中的葛根素HPLC检测结果如图4所示。直接醇提葛根渣所得葛根素HPLC色谱图如图5所示。

图4 葛根渣发酵后醇提液葛根素的HPLC图Fig.4 HPLC chart of puerarin in alcohol extract of Pueraria root residue after fermentation

图5 葛根渣醇提液葛根素的HPLC图Fig.5 HPLC chart of puerarin in alcohol extract of Pueraria root residue

由图4可知，根据样品色谱峰面积，求得葛根素含量为5.68 mg/g。由图5可知，根据样品色谱峰面积，求得葛根素含量为3.25 mg/g。可见，由于黑曲霉固态发酵葛根渣产生的木聚糖酶、CMC酶对葛根细胞壁纤维结构的降解破坏作用，使得葛根渣发酵后醇提液中的葛根素含量比直接醇提葛根渣所得葛根素提高了74.8%。

3 结论

本文研发了一项利用葛根加工废弃物葛根渣来高效制备葛根素的技术。用黑曲霉对葛根渣进行固态发酵，产生的木聚糖酶和CMC酶可以降解葛根细胞壁的半纤维素和纤维素，达到破坏细胞壁纤维结构、增大细胞壁通透性从而使葛根素易于溶出的目的。8.0 g葛根渣经固态发酵120 h后，利用HPLC检测的葛根素含量高达5.68 mg/g，比直接醇提葛根渣获得的葛根素含量提高了74.8%，实现了葛根素的高效制备。