均相时间分辨荧光免疫法检测降钙素原的性能评价

江长绿,刘结清,陈飞宇,江文力,黄昊川,杜利军

广州市花都区人民医院检验科,广东广州 510800

降钙素原(PCT)为无激素活性的降钙素前肽物质，在内毒素等细胞因子诱导下，2～3 h开始增加[1-3]，6～8 h体内水平快速升高，12～48 h到达峰值,2～3 d后恢复正常，为感染性疾病诊断及鉴别诊断的有效指标[1-3]。当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时，其在血浆中的水平升高，自身免疫性疾病、过敏和病毒感染时PCT水平不会升高。PCT水平升高的幅度与细菌感染的严重性有关[4]。PCT>0.5 μg/L时，应考虑患者是否具有发展为严重脓毒症或败血症休克的风险[5-6]。潜在细菌感染的成功治疗往往伴随着PCT水平的降低，恢复正常的半衰期为24 h[7]。常见的检测方法有时间分辨荧光免疫法[5](TRFIA)、化学发光法(CIIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫层析法(ICT)，而TRFIA又有均相TRFIA与非均相TRFIA之分，均相TRFIA简化了常规TRFIA检测中“冲洗”的步骤，既减少了反应体系误差，又使得整个反应过程更为快捷。本研究依据美国临床实验室标准化协会(CLSI)EP系列文件及原中华人民共和国卫生部相关文件要求，全面评价赛默飞KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析仪的检测性能，从而为临床感染性病例的诊治提供更为有效的数据支持。

1 材料与方法

1.1材料来源 参考区间验证标本:选取2021年3-10月本院体检中心体检血常规标本80份(其中男性40份、女性40份，年龄1～69岁，白细胞与C反应蛋白均正常，排除感染性疾病和其他急慢性疾病)，经2 500×g离心力离心10 min后用于参考区间的验证。其余实验标本均为本实验室完成常规检测后的剩余标本，对患者无任何损害，且试验结果只用于比对研究，不作为辅助诊断依据，不会给受试者带来任何风险[5]。

1.2仪器与试剂 评价仪器为赛默飞KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析仪,检测系统已获得国家市场监督管理总局认可，校准品批号LOT:25044/6A，质控品批号LOT:25038B,试剂批号LOT：25204C；比对仪器为雷度AQT90FLEX 免疫分析仪，校准品批号LOT:19605，质控品批号LOT:18426/17816,试剂批号LOT：19605。用于正确度验证的参考物质水平为28.7 μg/L。本评价所有试验均严格按照仪器标准化操作程序文件操作，试验前所有质控均参照《临床实验室定量测定室内质量控制指南：GB/T20468-2006》文件执行[8],且均在控。

1.3方法

1.3.1精密度验证 按照CLSI EP15-A2文件[9]要求，使用2个水平(低水平1和高水平2均接近医学决定水平)的患者血浆标本制备的质控血浆，每个水平各分装5管，冻存于-20 ℃以下，每天各解冻1管，上机重复测定3次，每次间隔2 h，共测5 d。分别计算批内和批间精密度的变异系数(CV)，根据国家临床检验中心室间质评标准，检测系统不精密度CV<1/4系统总误差(TEa)(±7.5%)。

1.3.2准确度验证 按照《能力验证规则：CNAS-RL02:2018》[10]要求,本实验室参加国家临床检验中心2021年4月组织的第一次PCT室间质评，将其发放的5份室间质评物质在评价仪器上进行检测，以室间质评回报结果的靶值作为标准，验证该实验室检测结果是否在允许范围内。

1.3.3正确度验证 根据《临床检验定量测定项目精密度与正确度性能验证：WS/T492-2016》[11]使用厂家提供的具有溯源性及互换性的正确度验证物质(参考物质水平为28.7 μg/L，不确定度为1.6)，在3～5 d内每批进行2次重复测定，然后计算均值、标准差、合成标准不确定度,以及95%CI等验证指定值。

1.3.4稀释度验证 选取40份接近检测线性上限的患者标本，水平介于40.83～48.15 μg/L，在评价仪器上分别进行50倍和100倍稀释检测，检测的结果与原始结果进行比较，计算相应偏倚，要求小于1/3TEa(10%)。

1.3.5线性范围验证 依据CLSI EP6-A文件[12]，准备水平为0.02～50.00 μg/L的两个低水平标本(L)和高水平标本(H)为母液(5 mL)，按(1∶L,2∶0.80 L+0.20 H,3∶0.60 L+0.40 H,4∶0.40 L+0.40 H,5∶0.20 L+0.80 H,6∶H)配成6个梯度的线性测量标本，每份为500 mL,每个水平标本分别上机检测2次，计算均值，绘制线性拟合曲线，要求R2≥0.95。

1.3.6干扰物验证 依据CLSI EP7-A2文件[13]，在血浆PCT低水平(接近临界值下限0.5 μg/L)和高水平(接近医学决定点2.0 μg/L)标本中加入临床常见干扰物质(清蛋白1 g/dL、未结合胆红素 20 mg/dL、三酰甘油22 mg/mL、洗涤红细胞配制血红蛋白500 mg/dL)，并检测干扰(为不影响临床误诊误治，以干扰<±10%为验收标准)。

1.3.7携带污染率验证 依据《临床血液学检验常规项目分析质量要求：WS/T406-2012》[14]要求,取高水平血浆标本,重复测定3次,分别获得结果H1、H2、H3，再取低水平血浆标本，重复测定3次，分别获得结果L1、L2、L3，代入公式(L1-L3)/(H3-L3)×100%,计算其携带污染率。

1.3.8参考区间验证 参照《医学实验室质量和能力认可准则在临床化学检验领域的应用说明：CNAS-CL02-A003:2018》[15]要求,因PCT水平在人群中呈偏态分布，故参考区间采用P95表示更符合临床，检测健康人群血浆PCT水平，计算其P95。

1.3.9不同仪器间比较 依据《医疗机构内定量检验结果的可比性验证指南：WS/T 407-2012》[16]要求，采用本实验室在用的雷度AQT90FLEX 免疫分析仪作为对照机型，将其与赛默飞KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析仪同时检测80例血浆标本，按试剂说明书对PCT不同水平(<0.5、0.5～<2、2～10 μg/L和>10 μg/L)进行临床意义的划分，4个水平的血浆标本数均为20例，对赛默飞KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT试剂盒和对照试剂检测的2组数据结果进行相关性统计评价。

1.4统计学处理 采用SPSS22.0统计软件进行数据分析。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验；线性及比对数据进行线性回归分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1精密度验证结果 按照CLSI EP15-A2文件要求，2个接近医学决定水平的自制质控血浆的批内精密度的CV分别为0.51%、3.47%，批间精密度的CV分别为1.66%、5.14%，均小于国家临床检验中心室间质评标准±7.5%(1/4TEa)，见表1。

表1 PCT精密度验证结果(血浆)

2.2准确度验证结果 2021年4月上报的5份标本室间质评结果均通过国家临床检验中心室间质评标准，检测结果均在允许范围内,成绩为100%，见表2。

表2 PCT准确度验证结果(血浆)

2.3正确度验证结果 均值为28.11 μg/L，标准差为0.61 μg/L，临界值为3.25 μg/L，95%CI为27.48～28.74 μg/L，指定标准差为1.6 μg/L，合成标准不确定度为1.612，测量不确定度验证限为22.87～33.35 μg/L，验证物质的水平均落在以上验证区间内，仪器正确度通过验证。

2.4稀释度验证结果 40份接近检测线性上限的患者标本，稀释50倍偏倚为±7.2%,稀释100倍偏倚为±7.4%，结果偏倚均<±10%(1/3TEa)。

2.5线性范围 通过具有梯度水平的血浆标本进行验证，得出回归方程Y=1.000X-0.708，R2=0.998，表明检测范围在0.02～50 μg/L 内呈线性。

2.6干扰物验证结果 常见潜在的内源性干扰物对检测结果的影响均<±10%，见表3。

表3 常见潜在的内源性干扰

2.7携带污染率 赛默飞KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析仪的携带污染率为0.03%，见表4。

表4 赛默飞KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析仪携带污染率测定结果

2.8参考区间验证 检测80份健康人群的PCTP95为0.064 μg/L，且与性别无关，男性与女性的结果差异无统计学意义(P<0.05)，95%CI相近重叠，见表5。

表5 健康人群的PCT P95与95%CI

2.9实验室不同仪器结果比较 赛默飞KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析仪与雷度AQT90FLEX免疫分析仪检测结果具有良好的相关性(R2=0.995)，线性回归方程Y=0.896X+0.055，在医学决定水平0.5 μg/L和2.0 μg/L时相对偏差分别为8.83%和7.95%,均<±10%(CLIA88/2)。

3 讨 论

PCT自上世纪90年代问世以来一直备受临床关注，不仅在细菌(特别是革兰阴性菌)感染、脓毒血症等方面为临床提供有效、高特异度的参考依据，同时，在上、下呼吸道感染，主要在社区获得性肺炎(CAP)、急性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)等疾病中，为鉴别是否存在细菌感染和可疑感染提供有力参考，有效防止抗菌药物滥用。PCT水平下降也是临床治疗有效的可靠反馈。正因为PCT在临床上具有如此举足轻重的地位，更加要求实验室检测方便快速，而对检测仪器进行全面系统的性能验证，才能为临床提供准确可靠的检测结果[17-19]。

为充分了解赛默飞KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析仪的性能，本实验室参照一系列文件要求，对其进行全面系统的性能评估。本研究表明，其批内精密度CV分别为0.51%、3.47%，批间精密度CV分别为1.66%、5.14%，均小于国家临床检验中心室间质评标准±7.5%(1/4TEa)，优于ELISA(CV为7%～10%)，这与文献[20]报道的结果一致。准确度与正确度均通过验证，表明其能为临床提供更加安全、准确、可靠的实验结果。稀释度在1∶50倍时偏倚<7.2%,1∶100倍偏倚<7.4%，可为临床重度感染患者提供更宽的检测范围，充分满足临床需求，优于同类型仪器(100 μg/L)。临床常见干扰物质(清蛋白1 g/dL、血红蛋白500 mg/dL、未结合胆红素20 mg/dL、三酰甘油22 mg/mL)的干扰度均<±10%，表明检测不受明显干扰，与厂家的宣传相符，已达到常规方法的抗干扰能力。携带污染率仅为0.03%，远低于文献[6]报道的同类型检测仪器的0.11%，表明其特异度良好，不会产生假阳性结果而误导临床诊疗。参考区间验证结果显示，PCTP95水平为0.064 μg/L，因PCT水平在人群中呈偏态分布，故参考区间采用P95表示更符合临床需求，且研究表明其无性别差异。本研究结果还表明，赛默飞KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析仪检测结果与本科室在用的雷度AQT90FLEX 免疫分析仪具有良好的相关性(R2=0.995)，且在医学决定水平0.5 μg/L和2.0 μg/L时相对偏差分别为8.83%和7.95%,均<±10%(CLIA88/2)。

综上所述，结合本实验室对赛默飞KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析仪3个月以来的使用经验，其特别适用于大量标本的检测，为一款自动化程度高、使用便捷、检测快速、结果准确可靠且故障率低的PCT检测分析仪。