冈田酸诱导人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y损伤

路亚岚，周 澧，韩云林，王克维，秦 川

(中国医学科学院 医学实验动物研究所 北京协和医学院 比较医学中心 国家卫生健康委员会人类比较医学重点实验室北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心，北京 100021)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种以进行性神经认知障碍为主要临床表现的神经退行性疾病，中国AD患者人数超过800万，是继心血管疾病、肿瘤和脑卒中之后的第四大杀手[1-3]。AD具有老年斑和神经原纤维缠结(neurofibillary tangle, NFT)两大病理学特征，分别由β-淀粉样蛋白(Amyloid beta, Aβ)和磷酸化Tau蛋白(p-Tau)蛋白的异常聚集形成。它们会诱发神经毒性作用，导致神经元和突触丢失，引起神经衰退[4]。目前靶向Aβ的数十种药物的临床实验均宣告失败，针对Tau蛋白的药物研发是一个重要的新方向[5]。而且Aβ的毒性作用也需要Tau蛋白介导，然而Tau蛋白异常磷酸化与神经元损伤之间的关系尚不十分明确[6]。因此，p-Tau蛋白的神经毒性作用的进一步阐述是一个重要的科学问题。冈田酸(okadaic acid, OA)是海洋生物中提取的一种蛋白磷酸酶的强效抑制剂，是建立Tau蛋白过度磷酸化模型的公认药物[7-8]。本研究采用OA诱导神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y，检测Tau蛋白磷酸化水平，细胞形态、细胞凋亡指标以及抗凋亡家族蛋白(inhibitor of apoptosis family proteins, IAPs)表达水平，探索Tau蛋白的异常磷酸化对神经元凋亡的影响，以及IAPs的调控作用，为AD的预防和诊疗奠定了重要基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人源神经母细胞瘤细胞系SH-SYSY(北京协和医学院细胞资源中心/国家实验细胞资源共享平台)。

1.1.2 主要试剂：OA(Sigma- Aldrich公司)；DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin, PS)、0.25%胰蛋白酶和磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)(Gibco公司)；RIPA裂解液和BCA试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；Protease inhibitor cocktail(Roche公司)；caspase 3和GAPDH抗体(CST公司)；β-actin抗体(Abcam公司)；p-Tau抗体(Thermo Scientific公司)；HRP标记山羊抗兔/小鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)；ECL发光试剂(Millipore公司)；TUNEL试剂盒(Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：将SH-SY5Y细胞(含10% FBS+1% PS的DMEM培养基)以5×105个/孔接种于6孔板，待细胞汇合度达到80%时，加入20和40 nmol/L OA，分别诱导0、12、24、48和72 h后倒置显微镜下观察拍照。

1.2.2 Western blot检测蛋白表达：收集OA诱导后的SH-SY5Y细胞团块，使用RIPA裂解细胞，提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。通过10%～15%的SDS-PAGE分离蛋白，300 mA恒流转膜后，5% BSA或脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗4 ℃过夜孵育，TBST 漂洗后加入二抗，室温孵育1 h后漂洗，使用ECL发光试剂盒和凝胶成像系统拍照。

1.2.3 透射电镜检测细胞超微结构：收集≥1×107个OA诱导后的SH-SY5Y细胞团块，加入2.5%戊二醛4℃固定过夜后，用PBS冲洗3次；之后1%锇酸4℃固定2 h，去离子水冲洗3次，每次10 min；梯度乙醇脱水、环氧丙烷置换处理，树脂浸透、包埋，制成90 nm厚的超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，应用JEM-1400 Plus电镜观察拍照。

1.2.4 TUNEL法检测细胞凋亡：OA诱导后的SH-SY5Y细胞经4%多聚甲醛固定，PBS清洗后，浸入封闭液中封闭10 min，PBS清洗后0.1% Triton X-100室温透化2 min，PBS清洗后，滴加TdT酶反应液，37 ℃避光孵育1 h后，浸入0.3% H2O2中室温封闭5 min，PBS漂洗后滴加Streptavidin-HRP工作液，37 ℃反应30～60 min，漂洗后滴加DAB染液显色，去离子水漂洗数次后封片，光镜下观察拍照。

1.2.5 RT-qPCR检测IAPs的mRNA水平：按照Trizol试剂说明书提取细胞样本RNA，测量浓度，使用PrimeScript RT Master Mix cDNA反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA。通过TB Green Premix Ex Taq TM Ⅱ(TliRNaseH Plus) 试剂盒对IAPs进行qPCR检测，β-actin为内参(表1)。使用FTC-3000p实时PCR系统完成实验后，采用2△△Ct法分析数据。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 OA诱导SH-SY5Y细胞Tau蛋白磷酸化

SH-SY5Y细胞经过OA诱导24 h后Tau磷酸化水平显著上调，在20 nmol/L时大约上调2倍，在40 nmol/L时约上调5倍(图1A～B)。

2.2 OA对SH-SY5Y细胞形态的作用

20 nmol/L OA处理细胞12 h后细胞开始变圆，贴壁能力减弱，神经突样结构变短，随着时间增加，细胞形态逐渐不规则，神经突样结构变短、消失，出现大量凋亡及死亡细胞，72 h后，细胞进一步皱缩、核凝集、碎裂，几乎全部死亡，培养基中存在大量漂浮细胞(图2A～B)。在相同时间下，40比20 nmol/L OA组的细胞形态异常更严重，在48 h时贴壁细胞数量显著减少(图2A)。

2.3 OA诱导SH-SY5Y细胞线粒体损伤

对照组线粒体双层膜结构清晰，线粒体嵴分布均匀；OA处理24 h后的线粒体明显肿胀，部分线粒体嵴稀少，排列紊乱；处理48 h后线粒体嵴断裂、退化甚至消失，比24 h更为严重(图3)。

2.4 OA诱导SH-SY5Y细胞凋亡检测

OA诱导24 h后几乎全部棕黄色着色，代表细胞大量凋亡发生，48 h时大量漂浮死亡细胞，残余细胞几乎全部皱缩，着色为棕褐色，发生严重的凋亡现象(图4A～B)。

2.5 OA促进SH-SY5Y细胞凋亡蛋白表达

随着OA的诱导，caspase3的活性状态比(cleaved /pro-caspase3)表达呈时间依赖性增加，具体为：24 h约为对照组2倍，48 h约为对照组4倍，72 h约为对照组8倍；在OA处理48和72 h后，40 nmol/L组caspase3的活性状态比高于20 nmol/L组(P<0.01)(图5A～B)。

2.6 OA诱导SH-SY5Y细胞的IAPs mRNA表达

OA诱导SH-SY5Y细胞24 h后，7个IAPs家族成员在20和/或40 nmol/L有不同程度的显著上调，其中cIAP1、cIAP2、apollon和livin在OA两个浓度条件下均显著上调(P<0.05)(图6)。

表1 IAPs qPCR引物列表Table 1 IAPs qPCR primers list

A.Western blot; B.quantification analysis of p-Tau in OA induced SH-SY5Y cells; *P<0.001 compared with control group; #P<0.01 compared with 20 nmol/L OA group

A.SH-SY5Y cell morphology after 20 nmol/L (up) and 40 nmol/L (down) OA treatment for 0, 12, 24, 48 and 72 hours; B.the measure of axon length; *P<0.001 compared with control group

Representative images for SH-SY5Y cells mitochondrial structure damage in OA (20 nmol/L) treatment for24 hours and 48 hours

A.representative TUNEL images were shown in OA (20 nmol/L) treatment for 24 hours and 48 hours; B.qualification of apoptotic cell ratio upon OA treatment; *P<0.001 compared with control group

A.Western blot of pro-caspase 3 and cleaved-caspase 3 in OA induced SH-SY5Y cells; B.quantification of cleaved/pro-caspase 3 grayscale value in 20 nmol/L and 40 nmol/L OA induced SH-SY5Y cells;*P<0.01, **P<0.001 compared with control group (0 hours);#P<0.001 compared with 20 nmol/L OA treatment for 48 hours; △P<0.001 compared with 20 nmol/L OA treatment for 72 hours

*P<0.05, **P<0.01 compared with control group图6 OA诱导的SH-SY5Y细胞的IAPs蛋白mRNA水平表达量Fig 6 OA induced SH-SY5Y cell IAPs mRNA level were detected by n=3)

3 讨论

突触、神经元的丢失是AD的关键特征，也是功能异常的重要原因[8-9]。Tau蛋白是一种重要的微管相关蛋白，在维持微管的稳定性、轴索的运输以及轴突的生长中具有重要作用[4]。天然状态很少有聚集的趋势，其过度磷酸化会丧失与管蛋白结合的能力，使其更容易聚集成双螺旋纤维丝，形成NFT，导致其相关的胞体和轴突物质转运障碍以及相应的神经元活性降低[4]。本文通过OA诱导Tau蛋白异常磷酸化，模拟NFT，结果发现确实可促进细胞损伤(细胞形态异常、细胞凋亡、活性caspase 3表达量上调)，提示在AD患者脑组织中过度磷酸化的Tau蛋白形成的NFT会随时间积累，诱导进行性的神经元损伤。此外，通过该模型的OA诱导细胞在40 nmol/L OA诱导条件下24 h内即出现大面积凋亡，损伤非常严重，在大多数实验中建议选择20 nmol/L OA。

细胞凋亡是一种细胞程序性死亡，主要包括内部线粒体途径、外部凋亡途径和B粒酶介导的细胞凋亡[10-11]。通过超微结构分析发现，细胞线粒体形态明显异常，出现肿胀、双层膜结构受损，脊消失等表型，提示内部线粒体途径参与OA诱导的细胞凋亡过程。在AD患者尸检中发现线粒体形态和功能障碍，以及相关的自由基、脂质/蛋白过氧化，在APPswe/PS1dE9小鼠中也发现类似的线粒体功能障碍[12]。线粒体损伤是AD的一个共性特征，因此，增强线粒体蛋白代谢，研发维持线粒体结构和功能稳定性的药物可能是AD防治的一个可行的策略。

IAPs家族蛋白作为抵抗细胞凋亡的关键蛋白家族之一，在OA诱导的细胞凋亡过程中，IAPs家族成员呈不同程度上调，表明作为重要的抵抗凋亡因子参与细胞保护[13]。由此推测在阻止AD进程中可能发挥功能，进一步探索该家族成员功能，尤其是cIAP1、cIAP2、apollon和livin蛋白，可能会为预防/延缓甚至治疗AD的进展提供方向。

综上所述，本研究系统揭示了OA诱导的Tau蛋白异常磷酸化可能是通过内源线粒体途径诱导细胞凋亡，在这个过程中IAPs家族蛋白各成员都是显著上调，积极对抗凋亡作用。本研究阐述了NFT与突触神经元丢失的可能机制，同时为AD的治疗的可能靶点(比如：减少Tau异常磷酸化、对抗线粒体凋亡途径、上调抗凋亡家族蛋白)提供了思路。