甘蓝型油菜莫利CMS(Moricandia CMS)的种质创制

陈 丽， 杨雯竹， 胡彩红， 杜才富， 雷绍林

(1.贵州省油菜研究所， 贵阳 550081； 2.贵州省油料研究所， 贵阳 550006)

目前我国对油菜杂种优势的利用途径主要有：细胞质雄性不育(CMS)、细胞核雄性不育(GMS)、化学杀雄(CH)和自交不亲和(self-incompatibility)等，其中细胞质雄性不育因易于获得全不育群体，有利于杂交制种而在生产上得到广泛应用。常见的同源CMS有PolCMS、陕2 A CMS、NapCMS等；异源CMS有OguCMS、莫利CMS(MoricandiaCMS)、DiplotaxiscatholicaCMS、OxyrrhinaCMS等[1]，其中莫利CMS系统在印度芥菜型油菜生产上得到了广泛应用[2-3]。

莫利CMS是Kirti P B、Prakash通过将Moricandiaarvensis(MM, 2 n=28)与Brassicjuncea(AABB, 2 n=36)进行体细胞融合(2 n=64,MMAABB),再用芥菜型油菜不断回交，获得的一种芥菜型油菜细胞质雄性不育系统[4-5],该胞质不育系统属于配子体不育，育性稳定且未发现其他胞质不良效应，其杂交种可育花粉与不育花粉各占50% ，但可育花粉量足够满足正常结实，对杂种产量并无影响[6]。目前研究表明，线粒体基因orf108-atpA共转录导致莫利CMS的雄性不育[7]，2015年Deepak等[8]将莫利CMS育性恢复基因定位在了A 09染色体，恢复基因的克隆工作仍在进行中。

一直以来，由于OguCMS具有不育彻底、易于保持的明显优势，是较理想的杂种优势利用途径[9-10]。然而由于国外专利保护，缺乏自有恢复源成为中国OguCMS 应用的主要技术障碍。目前国内关于莫利CMS在生产上应用的研究鲜有报道。本研究通过将莫利CMS引入甘蓝型油菜，创制一批甘蓝型油菜莫利 CMS材料，丰富了甘蓝型油菜不育胞质类型。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料主要有芥菜型油菜莫利 CMS商品杂交种F1代，2013年由华中农业大学涂金星教授提供；用于回交的甘蓝型油菜为贵州省油菜研究所稳定自交系材料；作为参照的甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜取自贵州省油菜研究所油菜种质资源库。

1.2 田间试验

以芥菜型油菜莫利CMS商品杂交种F1代为母本，以甘蓝型油菜自交系LZ 18001、LZ 18010等作为父本进行远缘杂交。继续以获得的F1代杂种为母本，以甘蓝型油菜优良自交系为轮回亲本连续回交5～6代，获得甘蓝型油菜莫利CMS候选株系若干。结合花粉活力鉴定结果以及套袋自交结实情况对候选株系进行回交、自交。同时对部分选育出的恢复系、不育系进行了杂交和自交，鉴定其恢复性。

1.3 花粉活力测定

采用醋酸洋红染色测定法。取油菜花3朵，将每朵花的花粉置于载玻片上，用1%的醋酸洋红染色液染色后盖上盖玻片(切勿压片)，在光学显微镜下观察计数(统计300个以上花粉粒)，大而圆且着色深的为可育花粉，小而瘪且着色浅的为不育花粉。计算可育花粉个数占所观察花粉总数的百分比，用来衡量植株花粉育性。

1.4 胞质分子标记检测

采用CTAB小样法提取基因组DNA[11]。本研究选用3个基于莫利CMS不育基因设计的特异引物orf108-O、orf108-N、orf108-B对转育的甘蓝型油菜莫利CMS材料以及其他胞质材料进行检测。扩增程序：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35个循环；最后72 ℃延伸5 min。

表1 甘蓝型油菜莫利CMS鉴定分子标记引物序列Table1 Primer sequences for identification of Mori CMS in Brassica napus L. by molecular marker

2 结果与分析

2.1 甘蓝型油菜莫利CMS不育系及恢复系材料的获得

2013年秋播莫利CMS不育胞质商品杂交种F1代，2014年3月花期选株以甘蓝型油菜材料作为父本进行第一轮去雄杂交，同年7月在贵州威宁县夏繁进行第一轮回交获得BC1种子。从2015—2016年正季和夏繁每年回交2代。2017年3月对获得的BC5F1代株系分单株进行套袋自交和花粉镜检，同时继续进行回交和杂交。

不育株获得：BC5F1中株系CGZ 909出现部分单株花粉活力小于3%，且套袋自交完全不结实(图1 A)；其他单株花粉活力在30%～80%之间，套袋自交不同程度部分结实(图1 B、C、D)。使用甘蓝型油菜自交系LZ 18010、LZ 18018、LZ 18022等对各不育株进行杂交，选择母本自交完全不结实的单株杂交种继续种植，并且对单株进行花粉活力鉴定以及套袋自交结实情况观察。结果显，株系CGZ 909不育彻底，植株杂交后代表现为较低的花粉活力以及彻底的套袋自交不结实性(图1 E)，其余株系不育株的杂交后代仍表现出不一致的花粉活力并且存在部分结实现象。于是将株系CGZ 909中不育株作为甘蓝型油菜莫利CMS候选不育系。

注：A为CGZ 909-7,花粉活力1.5%；B为CGZ 909-15,花粉活力44%；C为CGZ 909-25,花粉活力57%；D为CGZ 909-6,花粉活力76%；E为CGZ 909-7杂交F1代,花粉活力2%。图1 甘蓝型油菜莫利CMS部分不育株结实及花粉活力情况Fig.1 Seed setting and pollen viability of some sterile plants of Mori CMS in Brassica napus L.

可育株获得：株系CGZ 924、CGZ 925的大部分单株花粉活力在90%以上，且套袋自交结实正常；其余株系花粉活力在50%～90%之间，套袋自交包括正常结实、部分结实植株。对套袋自交结实正常的植株后代继续观察，发现株系CGZ 924、CGZ 925的自交后代花粉活力在90%以上、套袋自交完全可育(图2)。于是将株系CGZ 924、CGZ 925作为甘蓝型油菜莫利CMS候选恢复系。

注：A为甘蓝型油菜莫利CMS不育株，花粉活力3%；B为甘蓝型油菜莫利CMS株系CGZ 924可育株，花粉活力93%；C为甘蓝型油菜莫利CMS F1代植株，花粉活力49%。图2 莫利CMS在甘蓝型油菜中三系配套Fig.2 Three lines of Mori CMS in Brassica napus L.

分别以株系CGZ 924、CGZ 925作为父本与株系CGZ 909进行杂交，获得的F1代单株花粉活力约50%，套袋自交结实正常(图2)。表明实现了莫利 CMS在甘蓝型油菜中的三系配套，且在甘蓝型油菜中莫利 CMS仍表现为配子体不育的特点。

2.2 甘蓝型油菜莫利CMS分子标记辅助选择

Gaikwad等[12]、Kumar等[13]的研究表明，在芥菜型油菜中莫利CMS不育的形成与orf108-atpA共转录相关。于是本研究根据orf108-atpA基因序列设计了3对引物(orf 108-O、orf 108-N、orf 108-B)，来对甘蓝型油菜莫利CMS材料进行筛选。

随机选取甘蓝型油菜莫利CMS株系CGZ 909、CGZ 924、CGZ 925材料各2株；甘蓝型油菜常规材料10株(每5株等量混合，共2个混样)、甘蓝型油菜OguCMS材料10株(每5株等量混合，共2个混样)、白菜型油菜5株(共1个混样)、芥菜型油菜5株(共1个混样)。用3对orf 108引物对其进行特异性筛选，结果发现引物orf 108-O多态性较好(图3 A)。再利用引物orf 108-O对甘蓝型油菜莫利CMS及非莫利CMS材料进行进一步筛选(其中株系CGZ 909不育株30株、株系CGZ 924可育株30株、CGZ 925可育株30株、F1代可育株30株，甘蓝型油菜常规材料10株、甘蓝型油菜OguCMS材料10株、白菜型油菜5株、芥菜型油菜5株)。结果显，引物orf 108-O在甘蓝型油菜中对莫利CMS与其他系统材料有较好的区分度(图3 B显部分实验结果)。

注：A为分子标记初筛(1～2为甘蓝型油菜莫利CMS不育株；3～6为甘蓝型油菜莫利CMS可育株；7～8为甘蓝型油菜常规材料；9～10为甘蓝型油菜Ogu CMS材料；11为白菜型油菜；12为芥菜型油菜)，引物：orf 108-N、orf 108-B、orf 108-O；B为分子标记orf 108-O筛选(1～16为甘蓝型油菜莫利CMS不育株(S); 17～34为甘蓝型油菜莫利CMS可育株(F);35～51为甘蓝型油菜莫利CMS不育株与可育株杂交F1代;52～55为甘蓝型油菜常规材料；56～59为甘蓝型油菜Ogu CMS材料；60～61为白菜型油菜；62～63为芥菜型油菜)。图3 甘蓝型油菜莫利CMS胞质分子标记检测Fig.3 Cytoplasmic molecular markers detection of Mori CMS in Brassica napus L.

3 结论与讨论

本研究中所引入的莫利CMS系统在芥菜型油菜中表现为配子体不育类型。通过甘蓝型油菜与芥菜型油菜莫利CMS的多代回交、自交转育，发现莫利CMS系统在甘蓝型油菜中也表现为配子体不育的特点。因此，花期肉眼无法分辨出不育单株，转育过程中需通过单株套袋自交辅以花粉活力鉴定来对育性进行辨别。研究表明，在早期转育世代中，单纯以套袋自交结实情况很难快速选育出不育性稳定的株系。对转育的不同株系进行花粉活力鉴定，发现同为套袋自交不结实单株，花粉活力越低，其后代彻底不育株出现的概率越高。因此，选择花粉活力低、套袋自交不结实的株系作为后续甘蓝型油菜莫利 CMS不育系选育的基础材料；花粉活力高、套袋自交正常结实的株系作为后续甘蓝型油菜莫利 CMS恢复系选育的基础材料。

目前常见的甘蓝型油菜不育系统多为孢子体不育，配子体CMS不育株虽然与配子体不育株有着显著区别，但正常胞质可育株材料及其他不育系可育株材料很难在当代花期与甘蓝型油菜莫利 CMS系统材料进行区分。育种实践中为了防止育种材料的机械混杂，需在花期结束前对甘蓝型油菜莫利 CMS材料的细胞质进行辅助鉴定。由于本研究所使用的原始材料为芥菜型油菜莫利 CMS商品杂交种F1代，因此其分离出的不育株和可育株材料均携带有导致胞质不育的特有线粒体基因组。参考莫利 CMS在芥菜型油菜中的不育基因研究，根据orf108-atpA基因序列设计的引物orf 108-O对转育材料进行筛选，并获得较好的区分效果。

本研究中获得的甘蓝型油菜莫利CMS材料CGZ 909、CGZ 924和CGZ 925将作为下一步莫利CMS亲本选育工作的基础材料。