大白菜新品种陕秋白3号种子纯度的分子鉴定

和禹廷， 何 琼 ， 张妮南， 刘小愿， 张学芬， 王亚秀， 张鲁刚

(西北农林科技大学园艺学院， 陕西 杨凌 712100)

大白菜(Brassicarapas交系及其配组的3个苦瓜杂交一代组合为试sp.pekinensis)为十字花科芸薹属两性花异花授粉作物，具有显著的杂种优势。大白菜原产于中国，栽培面积和消费量在中国居各类蔬菜之首，素有“菜中之王”的美称。目前市面上多数大白菜品种均为杂交种，但是由于制种技术不成熟、成本高等问题，导致伪劣种子泛滥，农民损失严重[1-2]。杂交种纯度不但是种子质量标准要求，而且直接影响品种的杂种优势表现，因此，在杂交种销售之前，进行种子纯度鉴定是不可缺少的环节，这既可以保障农民权益，也可以维护企业信用，发挥新品种的优势，加快推广步伐。

遗传标记是指与目标性状紧密连锁，并同该性状共分离且易于识别的可遗传等位基因变异[3-5]。遗传标记在遗传学的建立和发展过程中具有重要作用，同时也是作物遗传育种的重要工具。20世纪70年代，遗传育种学家主要以形态学标记和生理生化标记作为遗传标记。生物技术的发展给作物的遗传育种研究带来了巨大的变化，分子标记相对于经典遗传育种中的遗传标记具有无可比拟的优越性，它的使用也越来越广泛。

SSR(Simple Sequence Repeat)即简单序列重复或微卫星DNA，又可称为短串联重复多态性，一般是由1～6个碱基对序列串在一起的序列重复[6]。这些重复单位的数目和重复序列的长度在不同品种或基因型中发生变异，因此导致重复序列的多态性，SSR两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，可根据两端序列设计一对特异引物，扩增每个位点微卫星序列。SSR所揭的多态性十分丰富，具有信息量高、呈共显性等特点[7]。目前已被广泛应用于小麦[8]、油菜[9]、辣椒[10]、黄瓜[11]、番茄[12]、灵芝[13]、榛子[14]、青梗菜[15]等植物。

陕秋白3号为西北农林科技大学园艺学院白菜课题组通过自交不亲和系培育出的性状优良的大白菜新品种。本研究采用SSR标记对陕秋白3号种子纯度进行快速鉴定，为加快推广提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 材 料

陕秋白3号杂交种子及母本14 S 104、父本14 S 472，均由西北农林科技大学十字花科课题组提供。PCR扩增所使用Mix采购于生工生物工程(上海)股份有限公司。28对核心引物由生工生物工程(上海)股份有限合成。

1.2 方 法

1.2.1育苗及DNA提取

在培养间对陕秋白3号杂交种子及父本14 S 472、母本14 S 104进行催芽，杂交种子正反交各催芽100粒，亲本10粒。播种于穴盘内，室温下生长，当幼苗长到3～4片真叶时，进行取样并提取DNA。DNA提取方法采用传统CTAB法。

根据测得的DNA含量C值将其统一稀释为200 mg/L，从亲本中分别选取5个已稀释的DNA样品各取10 μL，混合在一起建立亲本DNA池。

1.2.2特异扩增SSR引物筛选

以陕秋白3号亲本的DNA混合池为模板，以28对SSR引物进行PCR扩增，筛选在亲本与杂交种间具有扩增多态性的引物。

PCR反应体系包括DNA模板(200 mg/L)1 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，Mix 5 μL和ddH2O 3 μL。

SSR扩增程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，53 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s。共30个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。扩增产物在120 g/L聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，电泳参数设置：电压220 V，电流120 mA，时间1.5 h。电泳结束后，电泳产物采用简易银染法[16]进行银染并拍照。

1.2.3杂种一代群体检测

对陕秋白3号杂种一代的正交植株90株、反交植株94株用筛选到的共显性引物进行检测，计算杂交率，将分子鉴定结果与植株形态性状鉴定结果相比较，分析两种结果的一致性。

1.2.4陕秋白3号与同类品种的鉴定

为了进一步检测陕秋白3号纯度鉴定的特异性，利用筛选出的引物对同类品种秋白85、秦白二号、14杂1、27-2、金冠1号、改良青杂3号和秋早55进行鉴定，分析筛选出的2对引物是否可以有效区别其他品种。

2 结果与分析

2.1 特异扩增引物的筛选

利用28对SSR引物对父本14 S 472、母本14 S 104的DNA池进行PCR扩增及电泳检测，结果显，有2对引物可以扩增出共显性条带，这2对引物均在A 07染色体上(表1)，其中SSRA 07-1引物特异性强。利用这2对引物对亲本及杂种一代进行分子鉴定，其鉴定结果一致(图1)。

表1 引物SSRA 07-1和SSRA 07-2的序列Table 1 Primer sequences of SSRA 07-1 and SSRA 07-2

注：M为50 bp DNA Ladder；♀为母本；♂为父本；1～5为陕秋白3号杂一代单株。图1 2对特异扩增引物对父母本及其杂一代扩增 Fig.1 Amplification of 2 pairs of specific amplification primers for parents and hybrids generations

2.2 杂种一代陕秋白3号鉴定结果

利用在亲本中筛选出的具有多态性引物(SSRA07-1、SSRA 07-2)对正交90株、反交94株杂种一代进行鉴定，结果显，在这2对引物中均能扩增出明显条带。其中，SSRA 07-1扩增结果(图2)显，正交90株中有87株扩增出父母本共显性特异条带，编号3、6、82的3个单株扩增出父本特异条带，无母本特异条带，其杂交率为96.7%。反交94株中，有83株扩增出父母本共显性特异条带，编号6、16、22、23、29、82、83、84、90、92、94的11个单株扩增出父本特异条带，无母本特异条带，其杂交率为88.3%。

注：M为50 bp DNA Ladder；♀为母本；♂为父本；14～36为陕秋白3号杂一代单株。图2 2对特异扩增引物对陕秋白3号杂一代群体的纯度检测Fig.2 Purity test of two pairs of specific amplification primers to Shaanqiubai 3 hybrid generation

SSRA 07-2扩增结果(图2)显，正交90株中有87株扩增出父母本共显性特异条带，编号3、6、82的3个单株扩增出父本特异条带，无母本特异条带，其杂交率为96.7%。反交94株中，有83株扩增出父母本共显性条带，编号6、16、22、23、29、82、83、84、90、92、94的11株扩增出父本特异条带，其杂交率为88.3%。

2.3 杂种一代陕秋白3号田间鉴定及SSR鉴定比较分析

通过对陕秋白3号结球期田间形态学性状进行鉴定，其正交、反交杂交率分别为96%、89%，与SSR引物SSRA 07-1鉴定正交、反交杂交率分别为96.6%、88.3%结果接近。因此，利用SSR标记进行陕秋白3号大白菜种子纯度快速鉴定，可准确反映杂交种的真实纯度。

2.4 陕秋白3号与同类品种的鉴定结果分析

利用筛选出的具有多态性的SSRA 07-1、SSRA 07-2对同类品种秋早85、秦白二号、14杂1、27-2、金冠1号、改良青杂3号和秋早55进行鉴定。结果发现，这两对引物均可以有效地将陕秋白3号与这7个品种区分开(图3)，为在同类品种中快速筛选陕秋白3号提供了简便方法。

注：M为50 bp DNA Ladder；♀为陕秋白3号母本；♂为陕秋白3号父本；杂1、杂2为陕秋白3号；1为秋白85；2为秦白二号；3为14杂1；4为27-2；5为金冠1号；6为改良青杂3号；7为秋早55。图3 利用SSRA 07-1, SSRA 07-2引物鉴定同类型大白菜品种的电泳图谱Fig.3 The electrophoresis patterns of other seven Chinese cabbage varieties identified with SSRA 07-1, SSRA 07-2

3 讨 论

随着生物技术的发展，分子标记技术已经相对成熟，并且在遗传图谱构建、基因定位、种子纯度鉴定等领域都表现出了优越性。利用自交不亲和系配制一代杂种在十字花科蔬菜中被广泛采用。目前大白菜主要采用自交不亲和系制种。自交不亲和系的自交不亲和性受本身遗传性及环境的影响而有较大的变化，进而严重影响杂交种的杂交率[17]。当杂交制种过程控制不严时，也极易降低杂交率。种子纯度是决定作物种子质量的关键因素，因此在杂交种收获后，鉴定杂交种纯度是必要的。考虑到推广中可能出现的掺假、机械混杂、周期长等因素，种子纯度鉴定就成了品种推广中最为重要的工作。

种子纯度鉴定作为种子生产上必不可少的环节，传统的方法是进行形态学鉴定，对幼苗期、结球期、花期等性状进行观察鉴定，但是有许多不可避免的缺点，例如：播期不当容易引起种植失败[18]、统计性状记录员不同导致观察误差、实验周期长、浪费劳动力、成本高等。因此，随着种子纯度鉴定方法的发掘，RAPD标记[19]、SSR标记[20]、SRAP标记[21]、EST-SSR标记[22-23]等成为目前最为流行的种子鉴定手段。其中，SSR标记均匀分布、多态性高等优点可以避免传统形态学鉴定方法受到时间、植物发育时期对鉴定结果造成的影响。本试验采用SSR标记鉴定，从28对SSR引物中筛选出2对引物进行陕秋白3号的鉴定，其鉴定结果与田间性状鉴定结果非常接近，可以用于快速鉴定杂种一代陕秋白3号种子纯度。而且这2对引物均可以有效将陕秋白3号与秋白85、秦白二号、14杂1、27-2、金冠1号、改良青杂3号、秋早55大白菜品种区分开。本研究为陕秋白3号纯度快速鉴定技术，为加快其推广提供了技术保障。

4 结 论

本研究结果表明，可以利用SSR检测方法快速鉴定陕秋白3号，利用该方法可以有效、准确地检验出杂交种的纯度，为白菜生产节约了时间。同时，可以区分其他品种，为农业生产提供了简便高效的方法。