大麻二酚对人牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响

侯夏沛，刘 芬

(西北妇女儿童医院口腔科，西安 710061；*通讯作者,E-mail:fenfen2alei@163.com)

牙周炎是一种牙周支持组织的慢性感染性疾病[1]。牙周炎的主要病理改变之一是牙槽骨吸收，最终导致牙齿松动甚至脱落。干细胞在组织工程中具有巨大的自我更新能力和多向分化潜能[2]。人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells, hPDLSCs)具有多向分化潜能和高度的牙周相关性，是牙周组织工程的理想种子细胞，近年来在牙周再生医学领域受到广泛关注[3]。hPDLSCs作为牙周再生的基础，其数量和功能活性有限，这意味着寻找促进hPDLSCs增殖和成骨分化的因子或药物成为牙周组织工程再生治疗的另一个关键因素[4]。大麻二酚(cannabidiol，CBD)是大麻中的主要非成瘾性活性成分，具有抗痉挛、抗风湿性关节炎、抗焦虑、抗炎、抗氧化等药理活性[5]。据报道，大麻二酚可提高人牙龈间充质干细胞(human gingival mesenchymal stem cells, hGMSCs)的存活率[3]，以及促进hPDLSCs的存活和神经元分化[6]。我们推测大麻二酚可能在牙周组织重建、再生修复过程中具有潜在的促进作用。因此，本研究通过观察大麻二酚是否影响人牙周膜干细胞的增殖和成骨分化，从而为牙周组织重建提供候选药物。

1 材料与方法

1.1 材料

大麻二酚(纯度≥98%)购自上海同田生物技术股份有限公司。STRO-1、CD146、CD34、CD45、Collagen Ⅰ、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素(OCN)、β-actin一抗、山羊抗兔IgG H&L(HRP)二抗、FITC标记的荧光二抗均购自英国Abcam公司。MTT试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。二甲基亚砜(DMSO)购自北京康瑞纳生物科技有限公司。α-MEM培养基购自美国HyClone公司。碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)均购自碧云天生物技术研究所。茜素红染色液、苯甲基磺酰氟购自美国Sigma-Aldrich公司。TRIzol裂解缓冲液、Revertaid First Strand cDNA合成试剂盒、RIPA裂解缓冲液、BCA蛋白质测定试剂盒、增强化学发光(ECL)底物试剂盒均购自美国Thermo Fisher公司。TB Green PreMix Ex Taq Ⅱ(Tli RNAseH Plus)购自日本Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 hPDLSCs培养 收集西北妇女儿童医院口腔科收治的10个因正畸治疗拔除的健康第三磨牙或第一前磨牙，样本供者无牙周病。用0.01 mol/L的PBS冲洗牙齿，用刀片刮取根中1/3区域的牙周膜组织，将其剪成1 mm3左右的组织块，PBS冲洗，1 000 r/min离心5 min，使用2 ml Ⅰ型胶原酶在37 ℃消化15 min，然后终止消化并1 000 r/min离心5 min。将组织块置于6孔板中，用含有100 ml/L FBS的α-MEM培养液在37 ℃、5% CO2条件下培养。每隔3 d更换培养基。本研究已获得西北妇女儿童医院伦理委员会的批准，所有患者均签署了知情同意书。

1.2.2 流式细胞术鉴定hPDLSCs表面标志 取第3代hPDLSCs用胰蛋白酶消化处理，将细胞以1 200 r/min离心5 min，然后用PBS洗涤3次，以1 200 r/min离心5 min，除去上清液。将细胞在PBS中稀释至1×106个细胞/ml。将100 μl细胞悬液分别与STRO-1(1 ∶500稀释)、CD146(1 ∶500稀释)、CD34(1 ∶500稀释)和CD45(1 ∶500稀释)一抗在Eppendorf管中4 ℃孵育避光过夜孵育。用PBS取代一抗作为阴性对照。次日将细胞FITC标记的荧光二抗(1 ∶500稀释)室温孵育1 h，PBS洗涤后，将细胞以1 200 r/min离心5 min以获得细胞沉积物。将细胞沉积物重悬于PBS中，然后应用Beckman Coulter FC500流式细胞仪检测hPDLSCs的表面标志物(STRO-1、CD-146、CD34和CD45)。

1.2.3 MTT试剂盒检测细胞增殖 为了探索大麻二酚对hPDLSCs增殖的影响，通过MTT试剂盒检测hPDLSCs的活性。将hPDLSCs按照大麻二酚的处理浓度分为0.1，0.5，1，2，5，10，20，40 μmol/L组。大麻二酚用0.1%二甲基亚砜(DMSO)溶解。将hPDLSCs在96孔板(5×103个细胞/孔)中与不同浓度的大麻二酚(0.1，0.5，1，2，5，10，20，40 μmol/L)作用24 h后，再与100 μl的MTT孵育4 h，去掉上清液，每孔加入100 μl DMSO。最后用酶标仪测定其在572 nm处的吸光度。

1.2.4 细胞分组及成骨分化诱导 将hPDLSCs(5×103个细胞/孔)接种于96孔板中培养24 h，贴壁后将细胞分为4组，即对照组、0.5 μmol/L大麻二酚组(0.5 μmol/L组)、1 μmol/L大麻二酚组(1 μmol/L组)和10 μmol/L大麻二酚组(10 μmol/L组)。对照组加入不含大麻二酚的成骨诱导液(含有10% FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L抗坏血酸和10 nmol/L地塞米松的α-MEM培养液)，其他组分别加入含有指定浓度的大麻二酚的成骨诱导液。培养21 d，每2 d更换一次培养基。然后，使用碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒检测hPDLSCs的ALP活性，通过茜素红染色分析hPDLSCs中的钙化结节形成情况，使用qRT-PCR检测hPDLSCs中的Collagen Ⅰ、RUNX2和OCN的mRNA表达水平，使用Western blot检测hPDLSCs中的Collagen Ⅰ、RUNX2和OCN的蛋白表达水平。

1.2.5 碱性磷酸酶(ALP)活性测定 使用碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒检测hPDLSCs的ALP活性。hPDLSCs用成骨分化诱导培养基和大麻二酚联合培养21 d后，除去培养液，PBS清洗3次，用细胞裂解液裂解处理hPDLSCs。离心后，上清液用PBS稀释。细胞裂解液中加入50 μl发色底物孵育10 min，再加入100 μl反应停止液停止反应。最后用酶标仪检测各孔520 nm波长处的OD值。

1.2.6 茜素红染色分析钙化结节 hPDLSCs用成骨分化诱导培养基和大麻二酚联合培养21 d后，除去培养液，PBS清洗3次，用多聚甲醛固定细胞20 min，PBS清洗3次。用1 g/L茜素红染色液室温染色10 min，PBS清洗3次。在倒置显微镜下观察钙化结节，然后使用1 ml的1%氯化十六烷基吡啶溶解钙化结节，酶标仪检测590 nm波长处的OD值，用于钙化结节的定量分析。

1.2.7 qRT-PCR检测Collagen Ⅰ、RUNX2和OCN的mRNA表达水平 hPDLSCs用成骨分化诱导培养基和大麻二酚联合培养21 d后，除去培养液，PBS清洗3次，通过qRT-PCR检测hPDLSCs成骨分化过程中Collagen Ⅰ、Runt相关转录因子2(RUNX2)和骨钙素(OCN)的mRNA表达。hPDLSCs的总RNA用TRIzol裂解缓冲液分离。裂解产物用氯仿分离，4 ℃下12 000g离心15 min。然后，用异丙醇沉淀裂解产物，4 ℃下12 000g离心10 min。裂解沉淀物进一步洗涤，再悬浮在75%乙醇中，4 ℃下7 500g离心10 min，最后溶解在20 μl DEPC中。用Revertaid First Strand cDNA合成试剂盒分别从2 μg的mRNA中合成cDNA。用TB Green PreMix Ex Taq Ⅱ(Tli RNAseH Plus)在美国ABI 7500实时荧光定量PCR仪上进行qRT-PCR。β-actin作为内参基因。引物序列见表1，用2-ΔΔCt法检测基因表达。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.8 Western blot检测Collagen Ⅰ、RUNX2和OCN的蛋白表达水平 hPDLSCs用成骨分化诱导培养基和大麻二酚联合培养21 d后，除去培养液，PBS清洗3次，通过Western blot检测Collagen Ⅰ、RUNX2和OCN蛋白的表达。使用含有10 mmol/L苯甲基磺酰氟的RIPA裂解缓冲液裂解hPDLSCs。通过BCA蛋白质测定试剂盒测量hPDLSCs内总蛋白质的浓度。用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在100 V下对40 μg蛋白质电泳90 min。然后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，将膜在含有吐温20的Tris缓冲盐水中用5%脱脂乳室温下封闭1 h。然后将膜与Collagen Ⅰ(1 ∶3 000稀释)、RUNX2(1 ∶1 000稀释)、OCN(1: ∶500稀释)和β-actin(1 ∶2 000稀释)一抗在4 ℃孵育过夜。然后将膜与山羊抗兔IgG H&L(HRP)二抗(1 ∶2 000稀释)室温孵育1 h。使用增强化学发光(ECL)底物试剂盒显影。在Image J软件上分析蛋白质条带的灰度值。β-actin作为内参蛋白。

1.3 统计分析

本研究所有实验重复3次。实验数据以均数±标准差表示，用SPSS22.0软件进行统计分析，用GraphPad Prism 8.0软件作图。两组数据比较采用t检验，多组数据比较采用单因素方差分析(ANOVA)及LSD事后检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 hPDLSCs的形态学观察和鉴定

结果显示，hPDLSCs原代培养7 d时主要呈长梭形，少量hPDLSCs呈椭圆形或纺锤形，细胞核主要呈卵圆形，位于胞质中央，近似于纤维样细胞(见图1)。流式细胞术检测hPDLSCs表面标记物，结果显示hPDLSCs中STRO-1(98.58%)和CD146(99.20%)主要为阳性表达，CD34(0.36%)和CD45(0.31%)主要为阴性表达(见图2)。这些观察结果说明分离的细胞为hPDLSCs。

hPDLSCs原代培养7 d时主要呈长梭形，细胞核主要呈卵圆形，位于胞质中央，近似于纤维样细胞图1 hPDLSCs原代培养7 d的形态学 (×400)Figure 1 Morphology of hPDLSCs after primary culture for 7 d (×400)

图2 流式细胞仪检测hPDLSCs表面标志物STRO-1、CD146、CD34和CD45的表达Figure 2 Expression of hPDLSCs surface markers STRO-1, CD146, CD34 and CD45 by flow cytometry

2.2 大麻二酚对hPDLSCs增殖的影响

不同浓度的大麻二酚培养hPDLSCs处理24 h后，MTT法检测的相对细胞活力差异具有统计学意义(F=66.214，P<0.001)。与未处理的hPDLSCs(0 μmol/L大麻二酚)相比，0.5，1，2 μmol/L大麻二酚处理后hPDLSCs相对细胞活力依次升高(P<0.05)，10，20和40 μmol/L大麻二酚处理hPDLSCs后相对细胞活力依次降低(P<0.05)。5 μmol/L大麻二酚处理的hPDLSCs的相对细胞活力与0 μmol/L大麻二酚处理无显著差异(P>0.05，见图3)。在接下来的研究中将大麻二酚浓度设置为0.5，1，10 μmol/L共3个水平。

与0 μmol/L比较，* P <0.05图3 不同浓度的大麻二酚对hPDLSCs增殖的影响Figure 3 Effects of different concentrations of cannabidiol on the proliferation of hPDLSCs

2.3 大麻二酚对hPDLSCs ALP活性的影响

不同浓度的大麻二酚和成骨分化诱导培养基培养hPDLSCs 24 h后，各组细胞的ALP活性差异具有统计学意义(F=79.102，P<0.001)；与对照组相比，0.5 μmol/L组和1 μmol/L组hPDLSCs的ALP活性均显著升高(P<0.05)，10 μmol/L组hPDLSCs的ALP活性显著降低(P<0.05，见图4)。

与对照组比较，* P <0.05图4 不同浓度的大麻二酚对hPDLSCs中ALP活性的影响Figure 4 Effects of different concentrations of cannabidiol on ALP activity in hPDLSCs

2.4 大麻二酚对hPDLSCs钙化结节形成的影响

不同浓度的大麻二酚和成骨分化诱导培养基培养hPDLSCs 24 h后，细胞的钙化结节形成差异具有统计学意义(F=456.524，P<0.001)；与对照组相比，0.5 μmol/L组和1 μmol/L组hPDLSCs的钙化结节形成量(OD590 nm值)均显著升高(P<0.05)，10 μmol/L组hPDLSCs的钙化结节形成量(OD590 nm值)显著降低(P<0.05，见图5)。

图5 不同浓度的大麻二酚对hPDLSCs钙化结节形成的影响 (茜素红染色，×200) Figure 5 Effects of different concentrations of cannabidiol on the formation of calcified nodules in hPDLSCs(Alizarin red staining,×200)

2.5 大麻二酚对hPDLSCs中成骨相关基因和蛋白表达的影响

不同浓度的大麻二酚和成骨分化诱导培养基培养hPDLSCs 24 h后，各组细胞中Collagen Ⅰ、RUNX2和OCN的mRNA表达水平差异具有统计学意义(F=1 488.923，1 339.579，6 214.986，均P<0.001)。与对照组相比，0.5 μmol/L组和1 μmol/L组hPDLSCs的Collagen Ⅰ、RUNX2和OCN的mRNA水平均显著升高(P<0.05)，10 μmol/L组hPDLSCs的Collagen Ⅰ和RUNX2的mRNA水平显著降低(P<0.05)。但10 μmol/L组与对照组hPDLSCs中OCN的mRNA水平无显著差异(P>0.05，见图6)。

与对照组比较，* P <0.05图6 qRT-PCR检测不同浓度的大麻二酚对hPDLSCs中成骨相关基因转录的影响Figure 6 Effects of different concentrations of cannabidiol on the transcription of osteogenic genes in hPDLSCs by qRT-PCR

不同浓度的大麻二酚和成骨分化诱导培养基培养hPDLSCs 24 h后，各组细胞中Collagen Ⅰ、RUNX2和OCN的蛋白质表达水平差异具有统计学意义(F=1 261.531，2 101.101，4 987.369，均P<0.001)。与对照组相比，0.5 μmol/L组和1 μmol/L组hPDLSCs的Collagen Ⅰ、RUNX2和OCN蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)，10 μmol/L组hPDLSCs的Collagen Ⅰ和RUNX2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。但10 μmol/L组与对照组hPDLSCs中OCN蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05，见图7)。

与对照组比较，* P <0.05图7 Western blot检测不同浓度的大麻二酚对hPDLSCs中成骨相关基因表达的影响Figure 7 Effects of different concentrations of cannabidiol on the expression of osteogenic genes in hPDLSCs by Western blot

3 讨论

人牙周膜干细胞(hPDLSCs)是牙周组织再生工程技术的种子细胞之一[7]。hPDLSCs的成骨分化可能在牙周再生和修复方面具有巨大的潜力。据报道，hPDLSCs表达间充质干细胞STRO-1和CD146的表面标记[8]，流式细胞术检测STRO-1和CD146是目前公认的一种相对有效的hPDLSCs鉴定方法[9]。另外，CD34和CD45是造血干细胞表面抗原。本研究中分离的hPDLSCs主要呈长梭形，流式细胞术检测显示hPDLSCs中STRO-1和CD146主要为阳性表达，CD34和CD45主要为阴性表达，表明本研究成功地从牙周膜组织中分离出了hPDLSCs。目前，多项研究探讨了hPDLSCs在牙周组织再生修复中的潜力，然而，hPDLSCs的数量和功能活性有限，限制了其应用。学者普遍认为借助辅助药物来增加hPDLSCs的增殖和成骨分化能力更有助于提高其在口腔医学中的应用效果，然而，目前临床中缺乏有效的辅助药物。此外，由于大多数牙周病为炎症性疾病，牙周组织与其他组织的不同，它们在遇到炎症时不能再生[10]。使用具有抗氧化、抗炎的物质对干细胞进行预处理可以提高它们在患者重新植入组织中的存活率，并可以影响它们优先分化为特定的细胞谱系[6]。考虑到牙周慢性炎症性疾病，例如牙周炎，通常是由微生物诱导的牙菌斑形成所引起[11]。因此，开发具有抗炎作用的候选药物对于提高牙周组织再生修复中hPDLSCs的应用至关重要。大麻二酚是一种主要的非成瘾性大麻素类化合物[5]。多项研究报道了大麻二酚的调节免疫、抗炎、抗氧化等活性，本研究表明适当浓度的大麻二酚可促进hPDLSCs的增殖和成骨分化，因此，大麻二酚可能是提高hPDLSCs在牙周牙周组织再生中的应用效果的重要候选药物。

本研究首次考察了大麻二酚单独使用对hPDLSCs增殖的影响，结果表明合适浓度的大麻二酚具有促进hPDLSCs增殖的作用。在其他研究中，Libro等[12]研究了大麻二酚体外预处理人牙龈间充质干细胞(hGMSCs)是否能影响其表达谱，研究显示，大麻二酚通过抑制hGMSCs中NALP3、CASP1和IL18的水平来阻止NALP3炎症体通路的激活，并同时抑制凋亡；大麻二酚还能够调节间充质干细胞标志物(CD13、CD29、CD73、CD44、CD90和CD166)和其他表面抗原的表达。大麻二酚下调了参与免疫系统激活的抗原编码基因(CD109、CD151、CD40、CD46、CD59、CD68、CD81、CD82、CD99)，而上调了与免疫反应抑制相关的基因(CD47、CD55、CD276)，从而调节hGMSCs的免疫表型，同时提高其存活率[12]。另外，Lanza等[6]用Moringin和大麻二酚联合作用于hPDLSCs，发现联合治疗通过抑制凋亡而提高了hPDLSCs的存活率，表现为抗凋亡基因的表达增强和促凋亡基因的减少；进一步的研究证实，Moringin和大麻二酚通过PI3K/Akt/mTOR通路促进牙周膜干细胞存活[6]。这些结果提示大麻二酚促进hPDLSCs增殖的作用机制可能与其抗炎和抗凋亡作用有关。然而，值得注意的是，本研究也观察到当大麻二酚处理浓度大于或等于10 μmol/L时，hPDLSCs的增殖被抑制，这些结果提示过高的大麻二酚浓度可诱导hPDLSCs的死亡，因此，在大麻二酚的应用过程中应严格筛选和控制药物浓度。本课题组也将在之后的研究中进一步揭示高浓度大麻二酚抑制hPDLSCs增殖的具体分子机制，从而为大麻二酚的药物开发提供佐证材料。

成骨分化是牙周组织重建的关键步骤，本研究检测了大麻二酚对成骨分化诱导培养基培养的hPDLSCs中ALP活性、钙化结节形成和成骨相关基因和蛋白表达的影响。细胞中的ALP活性增高时，游离的磷离子可促进钙盐沉积和钙化结节的形成[13]。成骨蛋白(如Collagen Ⅰ、RUNX2和OCN等)作为一类与骨形成和骨重塑密切相关的蛋白质，在成骨过程中起着重要的调节作用，因此常被用作成骨细胞的表型标志物。Collagen Ⅰ已被证明影响成骨细胞的功能[14]，Collagen Ⅰ在人骨髓间充质干细胞骨向分化过程中不断增多[15]。RUNX2是成骨细胞和软骨细胞分化过程中的一个重要转录因子，负责将成骨细胞、间充质干细胞中的相关成骨基因进行转录、翻译和定向分化[16]。OCN是一种骨基质蛋白，能够和羟磷灰石结合并促进骨的形成和矿化[17]。本研究结果显示，0.5 μmol/L组和1 μmol/L组hPDLSCs中Collagen Ⅰ、RUNX2和OCN蛋白表达水平均显著升高，10 μmol/L组hPDLSCs的Collagen Ⅰ和RUNX2蛋白表达水平显著降低，0.5 μmol/L和1 μmol/L的大麻二酚升高了hPDLSCs的ALP活性、促进了钙化结节形成，并上调了Collagen Ⅰ、RUNX2和OCN的转录和蛋白表达，而当浓度为10 μmol/L时，则不利于hPDLSCs的成骨分化。因此，本研究首次揭示了适当浓度的大麻二酚可促进hPDLSCs的成骨分化。

综上所述，本研究表明适当浓度的大麻二酚可促进hPDLSCs的增殖和成骨分化，具有抗炎作用且无成瘾性的大麻二酚可能是牙周组织重建和再生修复的潜在药物。然而，本研究的不足之处是尚未进行动物实验，因此无法确定大麻二酚在体内是否也可提高hPDLSCs的牙周修复功能。在接下来的研究中，我们将进一步从多个角度来论证大麻二酚在牙周组织再生中的具体应用效果。