桑白皮黄酮提取物通过调控miR-223-3p表达对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的影响

王爱媛 刘姝 吴卫平 房辉 张雅中 吕月 韩晓东 张婷 唐文君 刘庆贤

(唐山市工人医院 1内分泌科，河北 唐山 063000；2神经内科；3心内科；4中医科；5肾内科；6老年病科；7皮肤科)

糖尿病肾病是糖尿病的常见并发症。研究表明，肾小球足细胞损伤是糖尿病肾病发生发展的重要环节〔1〕，寻找有效的方法降低或抑制足细胞损伤对于糖尿病肾病的治疗具有积极意义。桑白皮是双子叶植物桑科桑除去栓皮后的干燥根皮，具有补虚、活血祛瘀、化痰止嗽、生津止渴等作用。研究显示，桑白皮黄酮提取物可防治2型糖尿病大鼠非酒精性脂肪肝〔2〕，改善糖尿病小鼠物质代谢及能量代谢紊乱〔3〕。然而桑白皮黄酮提取物对糖尿病肾病足细胞损伤的作用还未知。非编码RNA中的微小RNA(miRNA)已被证明与糖尿病肾病有关〔4〕。研究显示，miR-223-3p在糖尿病肾病患者血浆中表达降低，且其表达与疾病严重程度有关〔5〕。目前，miR-223-3p在足细胞损伤中的作用还未知。本研究观察桑白皮黄酮提取物对高糖刺激的足细胞及miR-223-3p表达的影响，旨在探讨桑白皮黄酮提取物对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1实验试剂 小鼠足细胞购自上海研生实业有限公司，桑白皮药材购自广东省药材公司，胎牛血清(FBS)购自浙江天杭生物科技股份有限公司，膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，兔抗小鼠去氧肾上腺素(Nephrin)多克隆抗体购自英国Abcam公司，兔抗小鼠活化的半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)和结蛋白(Desmin)多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗小鼠波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体购自美国Cell Signaling 公司，miR-223-3p 模拟物(mimcs)和抑制剂购自广州锐博生物科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1桑白皮黄酮提取物的制备 参照文献方法提取桑白皮黄酮〔6〕。将500 g桑白皮药材(干燥粉末)与1 500 ml乙醇(80%)加热回流提取1 h，重复3次。将滤液旋转蒸发回收乙醇，浓缩至膏状。加入大孔吸附树脂、80%乙醇洗脱，收集洗脱液并回收乙醇，浓缩至膏状，真空冷冻干燥，得到桑白皮黄酮。

1.2.2细胞培养和转染 足细胞维持在含10% FBS的DMEM培养基生长，环境为37℃、CO25%、湿度97%。取对数增殖期的足细胞(5×104个)接种于6孔板中。参照LipofectamineTM2000试剂盒操作指示，分别将miR-223-3p mimcs、mimcs阴性对照(miR-NC)、miR-223-3p抑制剂(anti-miR-223-3p)及抑制剂对照(anti-miR-NC)转染至足细胞。转染时间为48 h。

1.2.3细胞分组处理 未转染的足细胞和转染后的足细胞，以2.5×104个/孔接种于24孔板中。未进行转染操作的足细胞分为对照组、高糖组和高糖+桑白皮黄酮提取物组。对照组细胞使用完全培养基正常培养48 h；高糖组细胞使用含30 mmol/L〔7〕葡萄糖的完全培养基培养48 h；高糖+桑白皮黄酮提取物组使用含30 mmol/L葡萄糖和50 μg/ml桑白皮黄酮提取物的完全培养基共同培养48 h。miR-223-3p组和miR-NC组使用含30 mmol/L葡萄糖的完全培养基培养48 h，并分别记为高糖+miR-223-3p组和高糖+miR-NC组。anti-miR-223-3p组和anti-miR-NC组细胞均使用含30 mmol/L萄糖和50 μg/ml桑白皮黄酮提取物的完全培养基共同培养48 h，并分别记为高糖+桑白皮黄酮提取物+anti-miR-223-3p组和高糖+桑白皮黄酮提取物+anti-miR-NC组。每组设置3个复孔。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 收集1.2.3分组处理的足细胞，用试剂盒中5 μl Annexin V-FITC、5 μl PI依次室温避光染色，上流式细胞仪检测。

1.2.5细胞中ROS含量测定 收集1.2.3分组足细胞，加入含有20 μmol/L二氯荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液，重悬细胞，37℃孵育2 h。1 000 r/min离心5 min，吸弃上清液。PBS溶液清洗细胞2次，用重悬细胞后荧光显微镜检测。激发波长500 nm，发射波长525 nm。以对照组的荧光强度为1，实验组与对照组的荧光强度比值表示ROS含量。

1.2.6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞中MDA和SOD水平 收集1.2.3分组足细胞，PBS清洗后，3500 r/min离心5 min。分别遵循MDA和SOD试剂盒操作说明，检测上清中MDA和SOD水平。

1.2.7Western印迹检测细胞中蛋白表达 收集1.2.3分组足细胞，用RIPA蛋白裂解液裂解细胞，4℃、12 000 r/min离心10 min收集在干净的EP管中。使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白试剂盒分析蛋白浓度。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离等体积的蛋白质(20 μg)，并转移到聚偏氟乙烯膜。分别用cleaved caspase-3、Nephrin、Desmin、Vimentin和GAPDH一抗孵育液4℃孵育过夜，与二抗免疫球蛋白(Ig)G孵育液37℃孵育2 h。并使用化学发光试剂和凝胶成像系统进行条带可视化，Image J软件以GAPDH为内参，进行条带分析。

1.2.8实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞中miR-223-3p表达 收集1.2.3分组足细胞，Trizol试剂提取细胞中总RNA。将RNA逆转录为cDNA根据RNA逆转录试剂盒进行，以cDNA为模板进行qPCR。引物序列：miR-223-3p上游 5′-GCCTTCTGCAGTGTTACGC-3′，下游5′-TAAGCATGAGCC ACAC TTGG-3′。采用2-△△Ct法计算足细胞中miR-223-3p相对于U6的表达水平。

1.3统计学分析 采用SPSS22.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1桑白皮黄酮提取物影响高糖诱导的小鼠足细胞凋亡 高糖组足细胞凋亡率和cleaved caspase-3蛋白表达水平与对照组比较显著升高(P<0.05)。与高糖组比较，高糖+桑白皮黄酮提取物组足细胞凋亡率和cleaved caspase-3蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见表1和图1、图2。

表1 桑白皮黄酮提取物对高糖诱导的小鼠足细胞凋亡的 影响

1～3：对照组、高糖组、高糖+桑白皮黄酮提取物组；图2、图3同图1 桑白皮黄酮提取物对高糖诱导的小鼠 足细胞凋亡的影响

图2 桑白皮黄酮提取物对高糖诱导的小鼠 cleaved caspase-3蛋白表达的影响

2.2桑白皮黄酮提取物对高糖诱导的小鼠足细胞氧化应激的影响 与对照组比较，高糖组足细胞中ROS和MDA水平显著升高(P<0.05)，SOD活力显著降低(P<0.05)。与高糖组比较，高糖+桑白皮黄酮提取物组足细胞中ROS和MDA水平显著降低(P<0.05)，SOD活力显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 桑白皮黄酮提取物对高糖诱导的小鼠 足细胞氧化应激的影响

2.3桑白皮黄酮提取物对高糖诱导的小鼠足细胞Nephrin、Desmin和Vimentin蛋白表达的影响 高糖组足细胞中Desmin和Vimentin蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)，Nephrin蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05)。桑白皮黄酮提取物组足细胞中Desmin和Vimentin蛋白表达水平比高糖组显著降低(P<0.05)，Nephrin蛋白表达水平比高糖组显著升高(P<0.05)。见表3和图3。

表3 桑白皮黄酮提取物对高糖诱导的小鼠足细胞Nephrin、 Desmin和Vimentin蛋白表达的影响

图3 Western印迹检测Nephrin、Desmin和 Vimentin蛋白表达

2.4桑白皮黄酮提取物对高糖诱导的小鼠足细胞miR-223-3p表达的影响 对照组、高糖组和高糖+桑白皮黄酮提取物组足细胞中miR-223-3p表达水平分别为1.03±0.09、0.34±0.03、0.75±0.06。与对照组比较，高糖组足细胞中miR-223-3p表达水平显著降低(P<0.05)。与高糖组比较，高糖+桑白皮黄酮提取物组足细胞中miR-223-3p表达水平显著升高(P<0.05)。

2.5上调miR-223-3p表达对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的影响 高糖+miR-223-3p组足细胞中miR-223-3p表达水平、SOD活力、Nephrin蛋白表达水平显著高于高糖+miR-NC组(P<0.05)，凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表达水平、ROS、MDA水平、Desmin和Vimentin蛋白表达水平显著低于高糖+miR-NC组(P<0.05)。见表4、图4。

表4 上调miR-223-3p表达对高糖诱导的小鼠足细胞凋亡和氧化应激及Nephrin、Desmin和 Vimentin蛋白表达的影响

1～2：高糖+miR-NC组、高糖+miR-223-3p组图4 上调miR-223-3p表达对高糖诱导的小鼠足细胞凋亡和cleaved caspase-3、Nephrin、 Desmin和Vimentin蛋白表达的影响

2.6下调miR-223-3p表达逆转桑白皮黄酮提取物对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的影响 与高糖+桑白皮黄酮提取物+anti-miR-NC组比较，高糖+桑白皮黄酮提取物+anti-miR-223-3p组miR-223-3p水平、SOD活力、Nephrin蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，凋亡率、cleaved caspase-3蛋白表达水平、ROS、MDA水平、Desmin和Vimentin蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图5、表5和表6。

1～2：高糖+桑白皮黄酮提取物+anti-miR-NC组、高糖+桑白皮黄酮提取物+anti-miR-223-3p组图5 流式细胞术检测小鼠足细胞凋亡和Western印迹检测cleaved caspase-3、Nephrin、 Desmin和Vimentin蛋白表达

表5 下调miR-223-3p表达逆转桑白皮黄酮提取物对高糖诱导的小鼠足细胞凋亡和氧化应激的影响

表6 下调miR-223-3p表达逆转桑白皮黄酮提取物对高糖诱导的小鼠足细胞Nephrin、Desmin和 Vimentin蛋白表达的影响

3 讨 论

足细胞是一种特异性终末分化的细胞，其位于基底膜外侧，与肾小球基底膜和血管内皮细胞共同构成肾脏的滤过屏障，在维持肾小球正常的结构和功能中发挥重要作用〔8〕。在糖尿病肾病发展过程中，高糖可损伤细胞线粒体，引起ROS积累过多，通过氧化应激等多种途径损伤足细胞，导致其脱落、活性降低甚至凋亡〔9〕。本研究显示，高糖作用小鼠足细胞后，细胞中ROS和脂质过氧化产物MDA〔10〕水平显著升高，而抗氧化酶SOD〔11〕活力显著降低，表明高糖诱导足细胞产生了氧化应激反应。同时，高糖还可能通过上调cleaved caspase-3正调节足细胞凋亡，与前人报道一致〔12〕。这表明高糖处理损伤了足细胞。而桑白皮黄酮提取物干预后，高糖诱导的足细胞氧化应激反应和凋亡降低，说明桑白皮黄酮提取物可降低高糖诱导的足细胞损伤。

Nephrin是足细胞上特异的跨膜黏附蛋白，也是肾小球滤过屏障的重要组成部分。研究显示，在糖尿病肾病患者及模型中，Nephrin呈低表达〔13〕。Desmin和Vimentin属于细胞骨架中间丝蛋白，是构成足细胞胞体和初级突起细胞骨架的重要组成部分。研究表明，正常足细胞中Desmin和Vimentin表达较低，当足细胞受到损伤时Desmin和Vimentin表达升高〔14，15〕。本研究显示，高糖处理可抑制足细胞中Nephrin的表达，促进Desmin和Vimentin表达，而桑白皮黄酮提取物可促进高糖诱导的足细胞表达Nephrin并抑制Desmin和Vimentin表达，表明桑白皮黄酮提取物可降低高糖诱导的足细胞损伤。

miRNA参与组织器官或细胞损伤的发生发展，与疾病的发展进程密切相关。研究显示，miR-223-3p表达上调可能是心脏损伤后纤维性修复重要调控基因〔16〕；上调miR-223-3p表达可能通过抑制肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6炎性因子的表达减轻脂多糖(LPS)刺激人脐静脉内皮细胞造成的内皮损伤〔17〕。目前，miR-223-3p对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的影响还未知。本研究显示，高糖可抑制足细胞中miR-223-3p的表达，提示miR-223-3p可能参与足细胞损伤过程。通过转染miR-223-3p mimics上调足细胞中miR-223-3p表达后，高糖诱导的足细胞氧化应激水平和凋亡降低，且Nephrin高表达，Desmin和Vimentin低表达，说明上调miR-223-3p表达可降低高糖引起的小鼠足细胞损伤。本研究还显示，桑白皮黄酮提取物可促进高糖诱导的小鼠足细胞中miR-223-3p表达，下调miR-223-3p表达逆转了桑白皮黄酮提取物对足细胞损伤的保护作用，提示桑白皮黄酮提取物可能通过上调miR-223-3p表达降低高糖引起的小鼠足细胞损伤。

综上所述，桑白皮黄酮提取物可降低高糖引起的小鼠足细胞损伤，其作用机制可能与上调miR-223-3p表达有关，为桑白皮黄酮提取物防治糖尿病肾病足细胞损伤提供了一定的理论依据。