结核杆菌Th优势表位肽促进人DC成熟及T细胞分化的研究

汪梦真 周宇 李翠 李可意 李世杰 洪亮 黄新亮

摘要：目的：探究DC负载Th优势表位肽促进人DC成熟及T细胞分化。方法：分离外周静脉血得单核细胞、以细胞因子IL-4和GM-CSF刺激获得DC，实验组以DC负载结核杆菌的Th优势表位肽（10 ug/mL）制备疫苗、对照组DC不负载表位肽，培养8天后流式仪鉴定DC的成熟度（表达CD40、CD80、HLA-DR的DC百分率）。各组DC和自身淋巴细胞按照1：20比例混合4天后，以流式仪鉴定T细胞首次分化的效应CD4+T。再以Th优势表位肽刺激淋巴细胞2天后流式仪鉴定T细胞再次分化的效应CD4+T。结果：实验组比对照组表达CD40、CD80、HLA-DR的DC细胞百分率升高，差异有显著性（p<0.05）;T细胞首次分化的效应CD4+T百分率、T细胞再次分化的效应CD4+T百分率升高，差异有显著性（p<0.05）;且T细胞再次分化的效应CD4+T比T细胞首次分化的效应CD4+T百分率升高，差异有显著性（p<0.05）。结论：结核杆菌Th优势表位肽刺激人DC后，能促进人DC成熟及T细胞分化。

关键词：结核病;树突状细胞;表位肽;淋巴细胞;疫苗

【中图分类号】 R52 【文獻标识码】 A      【文章编号】2107-2306（2022）12--02

结核分枝杆菌（MTB）是引起结核病的病原体，结核病是一种严重危害人类健康的慢性感染性疾病。自2006年以来全世界每年有近900万或以上的新发病例，2014年全球新发结核病人960万人，死亡150万人。我国是22个结核病高发国家之一，患病人数位居全球第二[1]。近年来，由于人口流动加速、免疫抑制药广泛应用、艾滋病的不断蔓延及卡介苗免疫效率低下等，我国结核病的发病率依然居高不下，发病总人数呈现上升势头，结核病疫情形势非常严峻[2]。全球近1/3人感染MTB，其中有90%的人处于潜伏感染状态。

目前仍不清楚结核杆菌诱导的确切免疫机制。已知记忆性T淋巴细胞表达细胞膜分子CD45RO和某些粘附分子;记忆性T细胞再次遇到同一抗原时，能够产生快速而强烈的免疫应答，在抵抗微生物感染和抗肿瘤中发挥了关键性作用;它比非记忆细胞免疫功能更强大且寿命更长，是机体抗结核免疫的基础，但其确切的免疫机制尚不清楚[3，4]。现在临床实验室诊断结核杆菌感染的结核杆菌标本阳性率不高;常规为结核菌素皮肤试验，由于采用纯化蛋白衍生物作为抗原，包括卡介苗和非结核分枝杆菌抗原存在广泛交叉反应而且检测结果有较高的假阳性和假阴性[5]从而限制TST的临床广泛应用。诊断结核感染的另一种常用方法是结核特异性T细胞免疫γ-干扰素释放试验，但其诊断的敏感性与特异性差异较大，且试剂价格昂贵、操作复杂[6-7]。

综上，疫苗仍是控制结核病流行的最佳策略[1]：亚单位疫苗的保护效果优于卡介苗、将可能成为卡介苗的理想替代品[8]。已知结核杆菌有多种抗原表位肽，查询最近的结核数据库、表位数据库、HLA基因频率数据库发现，Rv0934（350-364）的表位QVHFQPLPPAVVKL（表位肽2）属于HLA-DRB1*0901限制性Th细胞表位，而HLA-DRB1*0901等位基因在中国人群频率最高，能够覆盖最广泛的中国人群。利用流式细胞术，检测到了表位肽2够诱导肺结核患者产生同时分泌两种或以上细胞因子的多功能CD4+T细胞。且这种表位肽能激发更强大的免疫效应，成为优势表位肽[9]。确定T细胞表位，对表位疫苗设计、结核诊断试剂开发具有十分重要的意义[1]。目前树突状细胞（DC）的无动物血清培养技术已经成熟。德国美因茨大学（Mainz University）的Jonuleit等发现TNF-a、IL-1b和IL-6 3种CK（细胞因子）组合后，在无牛血清培养体系中能够将未成熟DC诱导成完全成熟的DC，避免了动物血清培养DC对人产生的毒副作用[3，9]。本文以DC负载结核杆菌优势表位肽为基础，进一步总结其促进人DC成熟及T细胞分化功能，以期深入探究结核病的新型防治措施。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象实验组和对照组各6例，平均年龄21岁，经健康体检无其他发病史，两组年龄及性别差异均无统计学意义。

1.1.2主要试剂人外周静脉血、无血清AIM-V培养液、DC表面标志分子CD40、CD80、HLA-DR的荧光素PE标记抗、IL-2、IL-4、IL-1b、TNF-α、IL-6、GM-CSF、FITC荧光素标记的抗人CD3单克隆抗体和PE标记的抗人CD4抗体（Biolegend公司）、Th优势表位肽DQVHFQPLPPAVVKL（武汉强耀生物科技有限公司合成）。

1.2方法

1.2.1制备DC疫苗

取实验组外周静脉血分离人外周血单个核细胞，并置于6孔板中，在37℃、含5%CO2的培养箱中培养3 h;6孔板中贴壁的为DC（收集未贴壁的细胞并且冻存，以便后期和DC混合培养）。向6孔板中加入100 ng/mL GM-CSF、100 ng/mL IL-4，加3 mL/孔无血清AIM-V培液。第3天DC中加入Th优势表位肽（10 ug/mL），并加入：TNF-a 10 ng/mL、IL-1b 10 ng/mL、IL-6 1000 U/mL。对照组以DC为对照，不加入Th优势表位肽，其余步骤相同。

1.2.2 DC负载Th优势表位肽疫苗的成熟度鉴定

倒置显微镜观察DC疫苗的形态变化、用台盼蓝染色检查细胞存活率。收集第8天的DC并用流式细胞仪检测各组DC表面标志分子CD40、CD80、HLA-DR。

1.2.3 T细胞的活化

各组DC计数，以1×106/mL作为刺激细胞，按DC：淋巴细胞=1：20的比例，让DC和复苏冻存的淋巴细胞混合，37℃置于5%CO2的培养箱中培养4天。

1.2.4 T细胞分化的鉴定

倒置显微镜观察淋巴细胞的形态变化、用台盼蓝染色检查淋巴细胞存活率。检测各组CD4+T细胞百分率：在每孔100 uL PBMC细胞悬液中，加入5 uL PE标记的抗人CD3克隆抗体、5 uL FITC标记抗人CD4单克隆抗体，4℃避光染色30 min，以流式细胞仪C6检测。

1.2.5再次诱导T细胞的活化

对各组再次诱导自身淋巴细胞：以微量移液管加Th优势表位肽10 ug/mL于细胞中培养2天。

1.2.6再次诱导后分化的淋巴细胞的鉴定

以倒置显微镜观察淋巴细胞的形态变化、用台盼蓝染色检查淋巴细胞存活率，并以流式细胞仪C6检测各组CD4+T细胞百分率。

1.3统计学分析

计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组比较用t检验，SPSS17统计数据。

2结果

2.1实验组和对照组表达CD40、CD80、HLA-DR的DC百分率

实验组比对照组表达CD40、CD80、HLA-DR的DC百分率显著升高（p<0.05）。见表1，实例如图1。DC形态实例如图2。

2.2实验组和对照组T细胞首次分化的效应CD4+T百分率

实验组DC首次诱导的效应CD4+T百分率（即实验组T细胞首次分化的效应CD4+T百分率）比对照组显著升高，差异有统计学意义（p<0.05）。见图3。实例如图3。CD4+T形态如图5。

2.3实验组和对照组T细胞再次分化的效应CD4+T

实验组DC再次诱导的效应CD4+T百分率（即实验组T细胞再次分化的效应CD4+T百分率）比对照组显著升高，差异有统计学意义（p<0.05）。见图6，实例如图7。CD4+T形态如图8。实验组和对照组DC再次诱导的效应CD4+T百分率的参考值见表2。

2.4 T细胞再次分化的效应CD4+T百分率和首次分化的效应CD4+T百分率

DC再次诱导的效应CD4+T百分率比首次诱导的效应CD4+T百分率显著升高，差异有统计学意义（p<0.05）。见图9。

3讨论

目前DC的无动物血清培养技术业已成熟，防治结核病的新型疫苗适宜在无动物血清培养技术下进行制备。以TNF-a、IL-1b和IL-6三种细胞因子组合后，在无牛血清培养体系中能够将未成熟DC诱导成完全成熟的DC，避免了动物血清培养DC对人产生的毒副作用[8]。Th优势表位肽是结核杆菌抗原Rv0934（350-364）的表位肽DQVHFQPLPPAVVKL、属于HLA-DRB1*0901限制性Th细胞表位，能被CD4+T识别。而HLA基因频率测试发现HLA-DRB1*0901等位基因在中国人群的频率最高。因此，疫苗一旦开发成功，适用人群广泛。因而本研究为体外构建结核疫苗提供了方便的安全的培养环境。

结核病的免疫机制中可能存在多种Th细胞的活化、分化和效应[3]。本文总结了检测CD4+T细胞的体外简易方法，若进一步通过临床研究、制定DC再次诱导后的CD4+T细胞的数量参考值范围，亦可据此评估患者的免疫功能。例如已知结核病为有菌免疫，若受检者该百分率高于正常值，可作为个体免疫功能增强及结核病的病因学诊断的依据;还可据此判断个体结核病预防或治疗效果的动态变化。

结束语

综上，结核杆菌Th优势表位肽刺激DC，能促使DC细胞成熟度增加，DC负载的结核杆菌Th优势表位肽诱导T细胞分化为效应CD4+T百分率上升、且再次诱导的效应CD4+T比DC首次诱导的效应CD4+T百分率升高。据此有望探索出基于临床前期结核病的新型防治方法：用DC负载结核杆菌Th优势表位肽的疫苗诱导外周血中T细胞，能增强机体抗结核杆菌的细胞免疫功能。

参考文献：

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[4]Y.Zou，H.Zhu，M.Pan.995 Identification of CD4+CD69+tissue-resident memory T cell in pemphigus lesions[J].Journal of Investigative Dermatology，2019，139（5）：124-132.

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[6]Al-Zamel FA.Detection and diagnosis of Mycobacterium tuberculosis[J].Expert Rev Anti infect Ther，2009，7（9）：1099-1108.

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[8]刘苏东.结核分枝杆菌免疫优势CTL和Th1表位的筛选与鉴定[D].南方医科大学，2016.

[9]  Jonuleit H， Kuhn U， Muller G. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions[J]. European journal of immunology，1997，27：3135-42.

基金项目：2021年安徽省大学生创新创业训练计划项目（S202110368043）

作者简介：汪梦真（2002-01）女，汉，安徽，本科学生，研究方向：卫生检验与检疫。