大黄素联合雷替曲塞抑制胰腺癌细胞增殖及对血管紧张素转换酶2、血管紧张素Ⅱ的影响Δ

马 晓，尚 昆，林海珊，王 婧

(首都医科大学附属北京友谊医院肿瘤科，北京 100050)

胰腺癌是发病率高、致死率高的消化道恶性肿瘤之一，具有起病隐匿、发展迅速和治疗效果欠佳的特点。即使目前肿瘤的靶向治疗及免疫治疗发展迅速，厄洛替尼、奥拉帕利和程序性细胞死亡蛋白-1抑制剂相继被纳入指南，但患者的生存期并未出现显著延长，治疗尚无明显突破。胰腺癌患者腹部胀满不适常见，大黄类药物有一定疗效，既往研究结果也发现大黄素具有保护胰腺、抑制胰腺癌细胞增殖的作用[1]。雷替曲塞为抗代谢类叶酸类似物，能够经过还原叶酸载体摄入肿瘤细胞，进而被叶酰聚谷氨酸合成酶转化成聚谷氨酸盐，并贮存于肿瘤细胞中，从而发挥更强的抑制胸苷酸合成酶作用，并能够延长抑制时间，有效提高抗瘤活性[2]。对于老年患者或者心脏风险大的患者，接受雷替曲塞治疗的安全性良好，因此，雷替曲塞在临床中应用广泛。本研究拟通过大黄素与雷替曲塞联合应用，观察其对胰腺癌细胞增殖能力的影响及对血管紧张素转换酶2(ACE2)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的作用效果，为临床用药提供更多理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

PANC-1胰腺癌细胞系购自江苏凯基生物技术股份有限公司，于含10%胎牛血清的1640培养基培养传代。

1.2 仪器

ELx800型酶标仪(美国BioTek公司)；NovoCyte 1040型流式细胞仪[艾森生物(杭州)有限公司]；UV-2450紫外光度仪(日本Shimadzu公司)。

1.3 药品与试剂

青霉素/链霉素溶液(批号：KGY002)、0.25%胰蛋白酶-EDTA细胞消化液(Trypsin-EDTA)(批号：KGY001)、磷酸盐缓冲液(PBS)(批号：KGB500)、Braford蛋白含量检测试剂盒(批号：KGA801)和全蛋白抽提试剂盒(批号：KGP250)均购自江苏凯基生物技术股份有限公司；胎牛血清(FBS)(美国ExCell Biology公司，批号：FSS500)；DMEM培养基(美国Gibco公司，批号：12800-082)；(上海ExCell公司)；1640培养基(美国Hyclone公司)；大黄素(美国Sigma公司)；雷替曲塞(南京正大天晴制药有限公司，国药准字：H20090325；规格：2 mg/支；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国Rapid Bio公司)。

1.4 实验分组

本研究共分为4组，对照组[给予0.1%二甲基亚砜(DMSO)]、雷替曲塞组(给予雷替曲塞)、大黄素组(给予大黄素)和联合用药组(给予大黄素+雷替曲塞)。

1.5 四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞活力

将PANC-1细胞铺于96孔板内，每孔加入50 μL细胞悬液(约1×104个细胞)，另加入1640培养液50 μL。待细胞充分贴壁后进行实验，按照不同组别分别给予雷替曲塞、大黄素以及两药联合处理，干预72 h后实验终止。96孔板每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，吸出上清液，每孔加入DMSO 150 μL，震荡混匀后，使用酶标仪测量波长为490 nm处的吸光度(OD)值，计算细胞增殖率。细胞增殖率=用药组平均OD值/对照组平均OD值×100%。

1.6 ELISA法测定白细胞介素(IL)6、IL-1β及肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平

分别收集对照组、雷替曲塞组、大黄素组和联合用药组细胞上清液，按照ELISA试剂盒的说明书进行检测。取出IL-6、IL-1β和TNF-α抗体包被板，将不同浓度的标准品及实验样本加入反应孔中，并用封板胶纸封闭，37 ℃孵育90 min；舍弃反应孔中液体，每孔加入洗涤液350 μL，反复洗板共5次；除空白孔之外，其余反应孔中加入生物素化抗体工作液100 μL/孔，用封板胶纸封闭，37 ℃孵育60 min并反复洗板；除空白孔外，各反应孔中加入酶结合物工作液100 μL/孔，用封板胶纸封闭，37 ℃孵育30 min后反复洗板；加入显色剂，37 ℃避光孵育15 min。加入终止液100 μL/孔，混匀后测量波长为450 nm处的OD值。

1.7 Annexin-V FITC/PI双染法检测PANC-1细胞凋亡情况

(1)将PANC-1细胞消化后，接种至六孔板，待PANC-1细胞贴壁后，根据不同组别加入相应的含药培养基，同时设立阴性对照组；(2)待各组药物作用48 h后用0.25%胰酶消化，收集细胞；(3)用PBS洗涤PANC-1细胞2次，收集5×105细胞；(4)每孔加入Binding Buffer悬浮细胞500 μL，并加入Annexin V-FITC 5 μL及Propidium Iodide 5 μL混匀；(5)避光反应10 min；用流式细胞仪进行检测细胞凋亡情况(参数：Ex=488 nm；Em=530 nm)。

1.8 蛋白质印迹法检测胰腺癌细胞内ACE2、Ang Ⅱ 表达水平

PANC-1细胞按照不同干预组，加入相应药物处理后提取细胞总蛋白，并测定蛋白浓度，每个样品上样30 g，进行蛋白电泳，电转移到PVDF膜，牛奶封闭后顺序加入ACE2、AngⅡ、GAPDH一抗(1∶1 000)及二抗(1∶5 000)，到达反应时间后，使用ECL试剂盒检测杂交信号，并计算ACE2、AngⅡ蛋白含量。

1.9 免疫荧光法测定ACE2、AngⅡ蛋白表达情况

将不同干预组的PANC-1细胞进行免疫荧光细胞化学染色，观察各组ACE2、AngⅡ蛋白表达情况。具体流程：(1)PBS反复洗涤3次，每次5 min；(2)弃去PBS，加入4%多聚甲醛，在37 ℃条件下固定40 min；(3)37 ℃条件下PBS再次洗涤3次，每次5 min；(4)使用0.1% Triton X-100在细胞膜打孔，室温(25 ℃)下反应20 min；(5)加入3% H2O2浸泡，抑制内源性过氧化物酶，室温下反应20 min；(6)37 ℃条件下PBS反复洗涤3次，每次5 min；(7)加入正常血清封闭液，每孔50 μL，37 ℃，反应30 min；(8)去除血清封闭液，直接加入相对应的ACE2、AngⅡ一抗；(9)滴加1%BSA按1∶500稀释的浓缩型FITC和Cye标记二抗，每孔50 μL，37 ℃避光孵育40 min；(10)37 ℃，PBS反复洗涤3次，每次5 min；(11)滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，稀释浓度1∶100)，37 ℃避光孵育5 min；(12)冲洗，室温下PBS洗涤4次，每次2 min；用激光共聚焦显微镜观察并摄取荧光图像。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 大黄素、雷替曲塞以及联合用药对PANC-1细胞增殖能力的影响

应用不同浓度大黄素(200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25、0.390 625和0.195 312 5 μmol/L)对PANC-1细胞进行刺激，MTT方法检测结果显示，单用大黄素刺激胰腺癌细胞，随着大黄素浓度的降低，胰腺癌细胞的抑制率逐渐降低，抑制率由54.53%逐渐降至3.31%，提示大黄素对胰腺癌细胞增殖能力的抑制作用呈剂量依赖性，见表1。应用不同浓度雷替曲塞(40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25、0.078 125、0.039 062 5 μg/mL)，MTT方法检测结果显示，单用雷替曲塞刺激胰腺癌细胞，其对胰腺癌细胞增殖能力的抑制作用亦呈剂量依赖性，随着雷替曲塞浓度的降低，胰腺癌细胞的抑制率由54%逐渐降至8.29%，见表2。根据IC50，后续选择大黄素100 μmol/L、雷替曲塞40 μg/mL进行实验。PANC-1细胞加药处理24、48及72 h，大黄素组的PANC-1细胞抑制率分别为11.72%、21.26%及46.73%，雷替曲塞组的抑制率分别为8.40%、19.59%及42.39%，联合用药组的抑制率分别为22.85%、47.75%及68.71%，联合用药组的抑制率高于大黄素组和雷替曲塞组。

表1 不同浓度大黄素对PANC-1细胞的增殖抑制作用Tab 1 Inhibitory effect of different concentration of emodin on the proliferation of PANC-1

表2 不同浓度雷替曲塞对PANC-1细胞的增殖抑制作用Tab 2 Inhibitory effect of different concentration of Raltetrexed on the proliferation of PANC-1

2.2 大黄素、雷替曲塞以及联合用药对PANC-1细胞上清液中IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α水平的影响

使用不同药物处理72 h时取细胞上清液，分别测定IL-6水平，结果发现，各用药组PANC-1细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.001)；雷替曲塞组PANC-1细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著低于大黄素组，联合用药组上述指标水平显著低于大黄素组和雷替曲塞组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 四组PANC-1细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平比较Tab 3 Comparison of IL-6, IL-1β and TNF-α levels in the supernate of PANC-1 cells among four

2.3 Annexin-V FITC/PI双染法检测大黄素、雷替曲塞以及联合用药对PANC-1细胞凋亡的影响

用药物干预PANC-1细胞72 h后，各用药组PANC-1细胞凋亡率均显著高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)；联合用药组PANC-1细胞凋亡率显著高于大黄素组和雷替曲塞组，差异均有统计学意义(P<0.01)，见图1、表4。

表4 四组PANC-1细胞凋亡率比较Tab 4 Comparison of apoptosis rate of PANC-1 cells

2.4 蛋白质印迹法检测大黄素、雷替曲塞以及联合用药对PANC-1细胞ACE2、AngⅡ表达的影响

用药物干预PANC-1细胞72 h后，提取细胞蛋白，测定ACE2、AngⅡ蛋白水平。结果显示，大黄素组、雷替曲塞组ACE2表达高于对照组，而联合用药组表达最高；大黄素组、雷替曲塞组ACEⅡ的表达低于对照组，而联合用药组表达最低，见图2、表5。

表5 四组PANC-1细胞ACE2、AngⅡ蛋白水平比较Tab 5 Comparison of ACE2 and AngⅡ protein levels in PANC-1 cells among four groups

A.对照组；B.大黄素组；C.雷替曲塞组；D.联合用药组A.control group; B.emodin group; C.raltitrexed group; D.combination group图1 四组PANC-1细胞凋亡情况Fig 1 Apoptosis of PANC-1 cells in four groups

图2 四组PANC-1细胞ACE2、AngⅡ蛋白表达情况Fig 2 Expression of ACE2 and AngⅡ protein in PANC-1 cells of four groups

2.5 免疫荧光法检测大黄素、雷替曲塞以及联合用药对PANC-1细胞ACE2、AngⅡ表达的影响

从激光共聚焦显微镜的观察结果可见，ACE2蛋白阳性表达呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光；ACE2表达部位在胰腺癌细胞的胞浆中，胰腺癌细胞的细胞核中无ACE2表达；大黄素及雷替曲塞单药组PANC-1细胞ACE2表达高于对照组，联合用药组PANC-1细胞ACE2表达较对照组明显升高，见图3。AngⅡ蛋白阳性表达呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光；AngⅡ表达部位在胰腺癌细胞的胞浆和细胞核中；大黄素组、雷替曲塞组PANC-1细胞AngⅡ表达低于对照组，联合用药组PANC-1细胞AngⅡ表达较对照组明显降低，见图4。

A. 对照组；B.大黄素组；C.雷替曲塞组；D.联合用药组A. control group; B. emodin group; C. raltitrexed group; D. combination group图3 四组PANC-1细胞ACE2蛋白表达情况Fig 3 Expression of ACE2 protein in PANC-1 cells of four groups

A. 对照组；B.大黄素组；C.雷替曲塞组；D.联合用药组A. control group; B. emodin group; C. raltitrexed group; D. combination group图4 四组PANC-1细胞AngⅡ蛋白表达情况Fig 4 Expression of AngⅡ protein in PANC-1 cells of four groups

3 讨论

胰腺癌是恶性度较高的肿瘤，具有病程短、进展快速和死亡率高的特点。胰腺癌的治疗方案仍值得进一步探索，亟需更为有效的药物延长患者生存期，提高患者生活质量[3]。

雷替曲塞为喹唑啉叶酸盐类似物，最初由英国Zeneca公司与Royal Mardsen医院合作开发，属于抗代谢类抗肿瘤药。雷替曲塞经还原叶酸载体摄入细胞被叶酰聚谷氨酸合成酶转化为聚谷氨酸盐形式贮存细胞中，发挥更强胸苷酸合酶抑制作用。雷替曲塞聚谷氨酸盐通过增强TS抑制能力、延长抑制时间而提高其抗肿瘤活性。由于其多聚谷氨酸盐代谢物的半衰期相对比较长，约为198 h，而常用的化疗药5-氟尿嘧啶(5-FU)的半衰期仅为20 min，因此，雷替曲塞能够维持较长时间发挥抗肿瘤作用。雷替曲塞与5-FU的作用靶酶虽然相同，但由于两者作用部位不同，代谢途径有差异，不易产生交叉耐药性，故雷替曲塞可作为胰腺癌5-FU耐药后的优化选择[4]。研究结果发现，大黄素可抑制肿瘤细胞的增殖，其机制包括抗胰腺纤维化[5]，抑制Stat3信号通路，增强表皮生长因子受体抑制剂对胰腺癌细胞的抑制作用[6]，激活凋亡和自噬途径[7]，抑制上皮间质转化[8]，下调缺氧诱导因子1α[9]，增强5-Aza-CdR对胰腺癌细胞肿瘤抑制基因P16的去甲基化作用等[10]。

本研究系统观察了大黄素、雷替曲塞单药及两者联合应用对胰腺癌PANC-1细胞的抑制作用。各用药组PANC-1细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。IL-6为核因子κB信号通路的下游炎症介质，能通过激活STAT3传递信号，阻断炎症过程中出现的细胞凋亡，促进微小体形成，促进胰腺癌细胞持续增殖和远处转移[11-12]。一项Meta分析研究结果指出，循环中IL-6水平有可能是一个独立的预后生物标志物，高IL-6水平与短总生存期相关[13]。下调IL-6的表达水平，可有助于实现抑制肿瘤的作用。IL-1由肿瘤细胞表达和分泌，可通过小G蛋白Ras诱导转录因子的激活，可诱导激活蛋白1的激活。高IL-6水平和高IL-1水平的患者表现出整体和无进展生存期缩短，肿瘤控制率降低[13]。本研究结果显示，大黄素和雷替曲塞单药均可有效降低PANC-1细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平，上述2药联合应用可使其进一步降低，对肿瘤的抑制作用显著增加。

近年来，临床肿瘤学的一个主要目标是促进细胞凋亡，有效杀灭肿瘤细胞。这一程序性细胞死亡过程由多种因素介导，凋亡通路与其他信号机制的相互作用也会影响细胞死亡[14]。本研究结果发现，联合用药组的PANC-1细胞凋亡率显著高于大黄素组及雷替曲塞组，提示上述两药联合应用可以产生协同作用，通过促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖。

既往研究结果证实，ACE2在胰腺中的表达具有保护胰腺作用[15-16]；可抑制胰腺癌细胞增殖、血管生成和转移[17-18]。ACE2高表达的肿瘤患者生存期相对更长，而ACE2低表达可作为预后差的指标之一[16]。下调ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴会促进肿瘤细胞的增殖及转移[19]。本研究在蛋白水平观察PANC-1细胞ACE2、AngⅡ表达的变化，结果证实，各用药组PANC-1细胞ACE2蛋白水平升高，且联合用药组最高；各用药组PANC-1细胞AngⅡ蛋白水平降低，且联合用药组最低，与既往研究结果一致。

中医学中虽无“胰腺癌”的病名，但就其临床表现，该病属于中医学“积聚”“结胸”和“黄疸”等范畴。中医古籍对其病因病机亦有不少论述，如《证治汇补》中记载，“积之始生，因起居不时，忧虑过度，饮食失节，脾胃亏损，邪正相搏，结于腹中”。“辨证论治”是中医治疗学的基本原则。胰腺癌晚期，热毒血瘀证型较为常见。利用中医辨证论治的观点，针对热毒血瘀证的胰腺癌患者，特别是对于便秘为主的患者，加强大黄通腑，有利于胃肠功能的恢复，提高疗效。

综上所述，本研究通过细胞实验证实了大黄素、雷替曲塞能够下调IL-6、IL-1β及TNF-α水平，促进胰腺癌细胞凋亡，实现对胰腺癌PANC-1细胞增殖的抑制作用；两者联合应用可起到协同效应，抑制肿瘤细胞增殖的作用更为明显，其机制可能与上调ACE2蛋白表达、下调AngⅡ蛋白表达有关，可为中西医结合治疗胰腺癌提供理论依据。