基于网络药理学预测芹菜素治疗系统性红斑狼疮的机制

乐纯琰 杨国蓉 傅杭杰 高天问 丁 滨 季巾君

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种复杂的自身免疫性疾病，临床表现广泛，从轻度皮疹到血液异常、肾损伤和神经精神受累等，其具体发病机制尚不清楚，一般认为与遗传、内分泌、免疫和环境因素（如饮食、药物、感染）等有关[1]。我国约有超过100 万SLE 患者，其中女性患者高达113/10 万人，且该数据呈现逐年上升的趋势[2]。全基因关联研究确定了50 多个与SLE 相关的基因位点，特别是涉及免疫调节途径的基因，其中包括干扰素调节因子5（IRF5）、信号转导子和转录激活因子（STAT）、白细胞介素10（IL-10）等[3]。大量研究表明，STAT 信号通路在SLE 中表达异常，STAT 蛋白被丝氨酸磷酸化后可进一步参与其他重要途径，如p38/MAPK 途径、mTOR 途径、蛋白激酶R 途径等[4]，而未磷酸化的STAT 也可以通过其他转录因子，如NF-κB 的相互作用参与其他基因的表达[5]。

根据《金匮要略》中升麻鳖甲汤研制而成的解毒祛瘀滋阴方已广泛用于SLE 的临床治疗，且疗效明显，主要成分之一的积雪草被证实有活血祛瘀的功效[6]。芹菜素是一种广泛分布于水果、蔬菜和中草药的天然黄酮类化合物，这类化合物作为自由基清除剂和抗氧化剂，表现出抗氧化、抗炎和抗癌的作用；能够抑制细胞周期，减少氧化应激，诱导凋亡，刺激免疫系统，影响包括p38/MAPK、PI3K/Akt 和NF-κB通路，在抗炎和免疫调节中有很好的应用[7]。因此我们推测积雪草中的芹菜素可能在治疗SLE 中发挥一定作用。但目前对于芹菜素治疗SLE 的研究尚未见报道，因此，本研究通过网络药理学的方法，利用多个数据库预测了芹菜素和SLE 的潜在靶点，并通过基因功能基因功能（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析研究芹菜素治疗SLE 的可能机制，研究流程图如图1 所示。

图1 基于网络药理学的研究流程图

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 材料：人肾上皮细胞（293T 细胞）购自中国科学院上海细胞库；pERα-Luc、pERβ-Luc、pNF-κB-Luc 及相应表达载体flag-ERα、flag-ERβ 和cmyc-NF-κB（p65）、Renilla 为实验室备存；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司（货号：E195A）；芹菜素购自上海源叶生物科技有限公司（货号：S31423-1g）。

试剂：DMEM 培养液（货号：SH30285.02）、胎牛血清（货号：SH30088.03）购自Hyclone 公司；脂多糖（LPS）（货号：L2880-10MG）、β-雌二醇（β-E2）（货号：E110145-1g）、二甲基亚砜（DMSO）（货号：D8418-50ML）购自美国Sigma 公司；SuperFectinTMⅡIn Vitro DNA Transfection Reagent 购自上海普飞生物有限公司（货号：2102-100）。

1.2 仪器与设备 超净工作台[苏州安泰空气技术有限公司，型号：SW-CJ-1F（D）/2FCD]；水平摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：TS-1）；CO2培养箱（日本三洋公司，型号：MCO-5M）；多功能酶标仪（赛默飞世尔科技公司，型号：5200110）。

1.3 实验方法

1.3.1 芹菜素靶点的筛选 利用NCBI 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）输入化合物名称，下载芹菜素的2D 结构，导入SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）及PharmMapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）数据库，预测出芹菜素的潜在靶点，借助Uniprot 蛋白质数据库（https://www.uniprot.org/）对筛选的蛋白质靶点进行矫正规范。

1.3.2 SLE 靶点筛选 以“systemic lupus erythematosus”为关键词输入OMIM（https://omim.org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）、DrugBank（https://go.drugbank.com/）及PharmGKB（https://www.pharmgkb.org/）数据库检索，整理删除重复项后即得到疾病相关靶点。

1.3.3 芹菜素-SLE 共同靶点筛选及“疾病-靶点-化合物”网络构建 将芹菜素和SLE 的靶点输入Venny2.1在线作图平台（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）绘制韦恩图，两者交集即为芹菜素和SLE 的共同靶点，并运用Cytoscape 3.8.2 软件构建“疾病-靶点-化合物”网络图。

1.3.4 芹菜素-SLE 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建及核心靶点的筛选 将筛选得到的共同靶点上传至STRING 在线数据库（https://www.stringdb.org/），设置蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为0.4，获得芹菜素-SLE 的蛋白互作关系，并将蛋白质相互作用关系下载为TSV 格式，利用Cytoscape 3.8.2 将其可视化为PPI 网络，进行共同基因的分析及核心靶点的筛选。

1.3.5 芹菜素-SLE 基因功能及通路富集分析 将共同靶点上传到DAVID 数据库中（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）进行GO 富集分析，基于R4.1.1软件用Bioconductor 生物信息软件包进行KEGG 通路富集分析，对芹菜素-SLE 共同靶点进行生物学功能及主要信号通路分析，将结果以条形图或气泡图形式输出。在本研究中，P＜0.05 被认为差异具有统计学意义。

1.3.6 双荧光素酶报告基因实验验证筛选的主要信号通路 293T 细胞铺48 孔板，将pERα-Luc、pERβ-Luc 和pNF-κB-Luc 荧光素酶报告基因质粒分别与相应 的表达载 体flag-ERα、flag-ERβ 和cmyc-NF-κB（p65）和内参质粒Renilla 共同转染24 h后，pERα-Luc 和pERβ-Luc 用β-E2（20 μg/mL）刺激，pNF-κB-Luc 用LPS（1 mM）刺激18 h 后收集细胞，用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行检测。本研究采用GraphPad Prism 8.3 软件对所得数据进行单因素方差分析，以P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芹菜素-SLE 共同靶点的筛选及作用靶点网络的构建 将通过NCBI 数据库获得的芹菜素2D 结构导入相应数据库，共预测出芹菜素潜在靶点77 个（见表1）。同时以“systemic lupus erythematosus”为关键词，筛选得到SLE 潜在靶点1016 个，韦恩图中取交集后获得共同基因21 个。将共同靶点导入Cytoscape 3.8.2 软件中，绘制出芹菜素-SLE-靶点相互作用网络，图中蓝色三角形代表21 个共同靶点，绿色锥形代表疾病，橙色菱形代表芹菜素（见图2）。

表1 芹菜素靶点信息

图2 芹菜素-SLE-靶点作用网络

2.2 PPI 网络构建及核心靶点的筛选 PPI 网络是通过上传21 个共同靶点到STRING 数据库，并以Confidence score＞0.4 和人类为条件筛选得到有关系的蛋白，并通过Cytoscape 软件将蛋白之间的相互关系进行可视化处理，获得了一个具有18 个节点，44条边的PPI 网络图（如图3）。在该网络图中，核心度较高的靶点用较大的节点和较亮的颜色表示，相关度较强的靶点边缘用较粗和较亮的线表示。选择核心度最大的3 个靶点作为芹菜素治疗SLE 的核心靶点：ALB、HSP90AA1 和ESR1。

图3 芹菜素治疗SLE 的PPI 网络

2.3 靶点富集通路分析 首先，将21 个芹菜素-SLE 共同靶点上传到DAVID 数据库进行GO 富集分析，包括生物学过程（biological process，BP）、细胞组成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三个部分。GO 数据分析共富集到37 条生物学功能、12 条细胞组成过程和26 条分子功能过程，以P＜0.05 和基因富集程度为筛选条件，分别选出前十的结果进行分析（如图4）。

图4 芹菜素-SLE 共同靶点的GO 生物学过程富集分析

再将21 个芹菜素-SLE 共同靶点经R 语言运行后进行KEGG 通路分析，共得到12 条KEGG 通路，分别为精氨酸和脯氨酸代谢通路（arginine and proline metabolism）、雌激素信号通路（estrogen signaling pathway）、苯丙氨酸代谢通路（phenylalanine metabolism）、组氨酸代谢通路（histidine metabolism）、化学致癌作用-受体激活（chemical carcinogenesisreceptor activation）、NF-κB 信号通路（NF-κB signaling pathway）、冠状病毒病-COVID-19（coronavirus disease -COVID -19）、血清素突触（serotonergic synapse）、血小板活化（platelet activation）、酪氨酸代谢通路（tyrosine metabolism）、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路（glycine，serine and threonine metabolism）、色氨酸代谢通路（tryptophan metabolism）。根据P 值，将12 条通路进行数据可视化分析，形成气泡图（见图5）。

图5 芹菜素-SLE 共同靶点的KEGG 代谢通路富集分析

2.4 双荧光素酶报告基因实验验证筛选的主要信号通路 双荧光素酶报告基因实验结果显示，芹菜素能够抑制由β-E2 激活的ERα 和ERβ 的转录，其中对ERβ 的影响极显著（P＜0.01）（见图6A、B）；同时，芹菜素能够显著抑制由LPS 诱导的NF-κB 转录（P＜0.05）（见图6C）。芹菜素的抑制活性表现出剂量依赖，但趋势不明显（P＞0.05）。

图6 不同浓度芹菜素对ERα（A）、ERβ（B）、NF-κB（C）转录活力的影响

3 讨论

SLE 是一种涉及多器官、多系统的炎症性自身免疫性疾病，发病机制尚不明确[1]，目前临床上的常用药有激素和免疫抑制剂等，但不良反应较大[6]。解毒祛瘀滋阴方以生地黄为君药，加以升麻、白花蛇舌草、薏苡仁、积雪草为臣药，增强清热解毒之功，再加以其他佐药和使药，起到滋阴益肾、清热解毒之效，在降低激素的毒副作用、缓解患者病情、改善体力和疲劳程度、促进生理和心理康复、提高生存质量方面大有裨益[6]。然而，中药复方由于活性成分复杂、作用靶点多样，阐明其药理作用机制的研究进展缓慢。网络药理学为化合物与疾病作用关系靶点和机制的研究提供了一个很好的平台，为后续实验的开展和创新提供了新的思路和理论基础。

本研究基于网络药理学筛选到了77 个芹菜素潜在靶点和1016 个SLE 疾病靶点，两者交集得到21 个芹菜素-SLE 共同靶点，其中TOP 前三为ALB、HSP90AA1 和ESR1。ALB 能调节凝血功能，降低炎症因子毒性，临床研究发现SLE 患者体内ALB 水平显著降低，推测可能与机体过度免疫有关[8]。HSP90是分子伴侣蛋白，参与炎症相关免疫过程，能促进各种促炎细胞因子和抗原相互作用；HSP90AA1 是HSP90 的家族成员之一，通过调控编码HSP90α 蛋白，参与机体的免疫和炎症反应[9]。雌激素已被证明在SLE 的发生发展中通过细胞内的ERα 发挥重要作用，ERα 由基因ESR1 编码。ESR1 的多态性与SLE 的易感性显著相关，并且雌激素的部分代谢物介导了SLE 风险的增加[10]。此外，ESR1 可以调节含三联基序的蛋白21（tripartite motif-containing protein 21，TRIM-21）的表达，从而抑制SLE 中细胞因子的产生[11]。从网络药理学研究来看，芹菜素对ESR1表现出良好的靶向作用，这可能是治疗SLE 的机制之一，抑制ESR1 可能成为未来治疗SLE 的新方向。

通路富集结果显示，共富集到12 条通路，所有通路的P 值均小于0.05，其中最为显著的是雌激素信号通路和NF-κB 信号通路。ESR1 和ESR2 编码ERα 和ERβ 亚型，两者不仅可以通过直接结合雌激素反应元件（estrogen response element，ERE）调节基因转录，还可以通过与其他转录因子相互作用来调节基因转录[11]。雌激素受体还可能与NF-κB 相互作用，引起DNA 上NF-κB 结合位点的调节，从而调节NF-κB 依赖的基因转录。雌激素受体以细胞类型特异性调节NF-κB 介导的基因表达，并在炎症过程中具有重要意义[12]。NF-κB 有助于骨髓中B 细胞和胸腺中T 细胞的成熟，在免疫系统发育中起着至关重要的作用，但是B 细胞和T 细胞的过度表达和失调都会导致SLE[13]。此外，NF-κB 信号通路还与肿瘤相关信号通路共同作用，参与机体免疫调节、炎症反应等生理过程，因此芹菜素可能通过参与雌激素信号通路、NF-κB 信号通路等多条通路在SLE 的治疗中发挥作用。

基于上述网络药理学的预测，对雌激素信号通路和NF-κB 信号通路进行双荧光素酶报告基因检测，结果显示芹菜素能够抑制ERα，并且显著抑制ERβ 和NF-κB 的转录。由于SLE 的发生较为复杂，转录活力的下降只是芹菜素治疗SLE 活性的初步验证，对其他通路及下游炎症因子的调控和表达的改善作用还需要进一步实验验证。

综上可见，芹菜素作为解毒祛瘀滋阴方中的一个活性化合物，可以调控多个与SLE 发病相关的生物学过程，ALB、HSP90AA1、ESR1 是3 个关键靶点，调控雌激素信号通路、NF-κB 信号通路等12 条相关信号通路，为展开相关的实验研究提供了方向。