基于网络药理学和生物信息学探讨健脾益气方治疗免疫性血小板减少症作用机制

姚轶敏 李 强

免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）是临床上最常见的自身免疫性出血性疾病，血小板破坏增加及生成减少是其主要表现，可导致皮肤黏膜出现瘀点、瘀斑、内脏出血甚至脑出血，危及生命。中医将ITP 称为“紫癜病”，属于中医“血证”等范畴，临床以“脾气虚弱，气不摄血”为基本病机，这也是健脾益气法治疗ITP 的理论依据[1]。中医或中西医结合治疗ITP 有独特优势，经激素治疗无效或复发的患者临床上采用中医治疗常可获得良好的临床疗效。但对于健脾益气法治疗ITP 的药效机制，尚缺乏足够的现代医学理论依据及有力的实验室证据。健脾益气方是在健脾方的基础上加减药味而成，组方为党参、甘草、茯苓、黄芪、茜草、白术、阿胶[2]，可以健脾、补气、养血，促进血液循环，在临床实践中被用于治疗ITP[3-4]。目前，对于该复方制剂的作用途径和作用靶点尚不清楚，这是限制其广泛应用的主要因素。在本研究中，利用网络药理学和生物信息学来鉴定和筛选健脾益气方治疗ITP 可能的机制和关键靶点。

1 资料与方法

1.1 健脾益气方药物活性成分及作用靶点的筛选通过中药系统药理学数据库（TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php）和BATMAN-TCM 数据库检索出健脾益气方中党参、甘草、茯苓、黄芪、茜草、白术、阿胶7 种中药的化学成分。根据药物动力学参数（ADME）对化学成分进行筛选，筛选标准：口服利用度（OB）≥30%，化合物类药性（DL）≥0.18。BATMAN-TCM 根据分数截止值为20，预测的候选目标（包括已知的目标）其得分不小于20，多次测试校正后设置P 值的截止值（调整后的P 值）小于0.05。将TCMSP 数据库和BATMAN-TCM 数据库筛选到的各味中药的活性成分进行映射，绘制韦恩图，获得健脾益气方主要活性成分。将筛选到的活性成分通过PubChem 数据库进行SMILES 晶体结构查询，将不能查询到晶体结构的活性成分进行剔除，将查询到的各活性成分晶体结构上传到SwissTargetPrediction 数据库进行靶点预测。然后通过Uniprot 数据库（https://www.uniprot.org/）将筛选出的靶点名称转化为Gene Symbol，并进行标准化，删除检索结果中重复的靶点，建立活性成分靶点数据集，备用。

1.2 ITP 疾病靶点的获取 以“immune thrombocytopenia”作为关键词，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）以及DisGenet（https://www.disgenet.org/）数据库中进行检索，获取ITP 相关的疾病靶点。然后通过Uniprot 数据库（https://www.uniprot.org/）将筛选出的靶点名称转化为Gene Symbol，并进行标准化，删除检索结果中重复的靶点，建立疾病靶点数据集，备用。

1.3 关键靶点筛选及构建蛋白相互作用（PPI）网络应用R 语言（涉及的R 包：ggplot2 包，用于可视化），将健脾益气方活性成分靶点和ITP 相关的疾病靶点进行映射，绘制韦恩图，获得健脾益气组分与ITP 交集靶标，即为健脾益气方治疗ITP 的关键靶点。将关键靶点在STRING 数据库在线平台（https://stringdb.org/）构建PPI 网络，限定研究物种为“homo sapiens”，最低相互作用评分设为“medium confidence”（＞0.4），其余参数保持默认设置，获得PPI网络，下载PPI 网路TSV 文件备用。

1.4 关键靶点基因功能（GO）注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 将药物-疾病共同基因用R 语言（R 包：clusterProfiler 包[1]，用于富集分析和可视化）进行GO 分析及KEGG 通路富集析和可视化。

1.5 TOP10 GO 注释和KEGG 通路富集分析 为了进一步筛选到可能的关键靶点，我们将关键靶点PPI网路TSV 文件导入Cytoscape 3.7.2 软件处理，通过Cytoscape 中的cytohubba 插件来评估程度。cytohubba 目前有12 种算法，各种算法之间没有优劣，本研究使用最新的MCC 算法，得到分数前十的基因，并用R 语言（R 包：clusterProfiler 包[1]，用于富集分析和可视化）进行GO 分析及KEGG 通路富集析和可视化，得出健脾益气方治疗ITP 的关键靶点和通路。

1.6 健脾益气方治疗ITP 自噬相关靶点 为了探讨健脾益气方治疗ITP 自噬相关靶点，我们将健脾益气方治疗ITP 的关键靶点与从人类自噬数据库中共获得基因（http://www.autophagy.lu/）进行映射，绘制韦恩图，获得健脾益气方治疗ITP 自噬相关交集靶标，即健脾益气方治疗ITP 自噬相关靶点。

1.7 健脾益气方治疗ITP 自噬相关靶点GO 注释和KEGG 通路富集分析 健脾益气方治疗ITP 自噬相关靶点用R 语言进行GO 分析及KEGG 通路富集析和可视化。

1.8 构建健脾益气方各味中药-活性成分－自噬相关靶点网络 将中药、活性成分及自噬相关靶点整理后导入Cytoscape 3.7.2 软件进行可视化分析。

1.9 推测健脾益气方治疗ITP 自噬相关可能的关键靶点 为了进一步分析健脾益气方治疗ITP 自噬相关关键靶点，我们将22 个活性成分的靶点分别与健脾益气方治疗ITP 自噬相关靶点进行映射，韦恩得到各活性成分治疗ITP 自噬相关靶点，根据靶点的计数，获得健脾益气方治疗ITP 自噬相关可能的关键靶点。

2 结果

2.1 健脾益气方活性成分-靶点网络的构建 根据筛选标准，在TCMSP 数据库中和BATMAN-TCM 数据库共筛选出健脾益气方中7 味中药及35 种活性成分，其中党参7 种、甘草8 种、茯苓2 种、黄芪5种、茜草3 种、白术7 种、阿胶3 种（见图1）。在Pub－Chem 数据库进行SMILES 晶体结构查询，其中22 种中药活性成分查询到了SMILES 晶体结构（见表1）。在SwissTargetPrediction 数据库进行靶点预测，所有成分得到靶点去除重复后有763 个。

图1 5 种中药在TCMSP 数据库和BATMAN-TCM 数据库中的共同活性成分韦恩图

表1 健脾益气方活性成分信息

2.2 ITP 疾病靶点的筛选及共同靶点PPI 网络构建 通过GeneCards、DrugBank 以及DisGenet 数据库进行检索，删除检索结果中重复的靶点，获得ITP相关的疾病靶点3130 个。将这3130 个疾病靶点与763 个健脾益气方活性成分的作用靶点用R 语言绘制韦恩图，两者取交集后获得疾病-活性成分共同靶点337 个，此即健脾益气方治疗ITP 有重要意义的靶点（见图2A）。在STRING 数据平台输入337 个共同靶点，分析后得到PPI 网络图（见图2B）。

图2 健脾益气方活性成分的作用靶点与ITP 相关的疾病靶点的韦恩图（A）；337 个共同靶点PPI 网络图（B）

2.3 337 个关键靶点GO 生物功能注释和KEGG 通路富集分析 为了分析这些共同靶点的潜在生物学功能，我们用R 语言对健脾益气方活性成分-ITP 疾病的337 个共同靶标进行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析以及可视化（见图3）。337 个共同靶点在生物过程方面，主要富集在肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修饰、肽基丝氨酸修饰；在细胞组分方面，主要富集在膜筏、膜微区、膜区；在分子功能方面，主要富集在蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性；KEGG 通路方面，主要富集在EGFR 酪氨酸激酶抑制剂抵抗、前列腺癌、PI3K/Akt 信号通路。

图3 健脾益气方活性成分-ITP 疾病的337 个共同靶标GO 富集分析和KEGG 通路富集分析可视化网路图

2.4 TOP10 靶基因GO 生物功能注释和KEGG 通路富集分析 根据MCC 算法，得到分数前十的基因是CCND1、BCL2L、CASP3、HSP90AA1、JUN、SRC、STAT3、MTOR、HIFA1、VEGFR，用R 语言对关键共同靶标进行GO 生物功能注释和KEGG 通路富集分析，得到GO 和KEGG 富集结果及富集分析图（见图4）。TOP10 共同靶点在生物过程方面，主要富集在抗生素反应、髓样细胞分化、上皮细胞增殖的正调控；在细胞组分方面，主要富集在RNA 聚合酶Ⅱ转录因子复合物、核转录因子复合物、谷氨酸能突触；在分子功能方面，主要富集在泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合、组蛋白去乙酰化酶结合；在KEGG通路方面，主要富集在癌症中的蛋白多糖、胰腺癌、PI3K/Akt 信号通路。

图4 根据MCC 算法，得分前十的健脾益气方治疗ITP 关键共同靶标（A）及其GO 富集分析和KEGG 通路富集分析可视化网路图（B）

2.5 健脾益气方治疗ITP 自噬相关靶点GO 生物功能注释和KEGG 通路富集分析 健脾益气方治疗ITP 的关键靶点与从人类自噬数据库中共获得基因进行映射，得到健脾益气方治疗ITP 自噬相关交集靶标36 个（见图5A）。将36 个共同靶标进行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析以及可视化（见图5B）。36 个共同靶标在生物过程方面，主要富集在肽基丝氨酸修饰、肽基丝氨酸磷酸化、细胞对氧化应激的反应；在细胞组分方面，主要富集在富含ficolin-1颗粒、膜筏、膜微区；在分子功能方面，主要富集蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、组蛋白脱乙酰酶结合、MAP 激酶活性；在KEGG 通路方面，主要富集在自噬、凋亡、胰腺癌。

图5 健脾益气方治疗ITP 自噬相关交集靶标韦恩图（A）；36个健脾益气方治疗ITP 自噬相关共同靶标GO 富集分析和KEGG 通路富集分析可视化网路图（B）

2.6 健脾益气方各味中药-活性成分－自噬相关靶点网络 应用Cytoscape 3.7.2 软件对中药、活性成分、自噬相关靶点进行可视化分析，得到中药-活性成分－自噬相关靶点网络图，见图6。

图6 中药-活性成分－自噬相关靶点网络图

2.7 健脾益气方治疗ITP 自噬相关可能的关键靶点 根据靶点计数分析，EGFR、PARP1、MTOR、BCL2L1、RAF1、BCL2、HDAC6 等是健脾益气方治疗ITP 自噬相关可能的关键靶点，见图7。

图7 健脾益气方各活性成分治疗ITP 自噬相关靶点计数柱状图

3 讨论

研究表明，ITP 患者的血小板自噬减少，血小板自噬通过PI3K/Akt/mTOR 信号通路进行调控[5]。升高的血小板自噬可能通过抑制血小板凋亡和提高血小板活力来延长ITP 患者血小板的寿命[5]。此外，自噬在巨核细胞生成、血小板生成和血小板功能中的新作用在血小板减少症患者中也已得到揭示[6]。这些提示通过对ITP 患者自噬调节有可能为ITP 治疗提供新的方向。

临床实践提示，健脾益气方在改善ITP 患者出血症状及调节免疫等方面具有良好的疗效[7]，但对于健脾益气方治疗ITP 的具体药效机制，尚缺乏足够的现代医学理论依据及有力的实验室证据。研究表明，党参的有效活性成分豆甾醇可以通过抑制Akt/mTOR 途径同时诱导胃癌细胞凋亡和保护性自噬[8]。雷帕霉素（mTOR）介导的自噬的哺乳动物靶标被鉴定为甘草有效活性成分葛兰素的潜在介质之一，通过保护软骨细胞免受氧化应激，细胞凋亡和促进mTOR 介导的自噬，保护特性软骨免受骨关节炎损伤的影响[9]。甘草和黄芪共同有效活性成分山奈酚与mTOR 抑制剂的作用相似，它可通过抑制人内皮细胞中PI3K/Akt/mTOR 通路上调自噬，从而减轻ox-LDL 诱导的细胞凋亡[10]。甘草和黄芪共同有效活性成分槲皮素通过Akt/mTOR 途径介导的自噬诱导对细胞迁移和糖酵解产生抑制作用[11]。茯苓有效活性成分茯苓酸，增加了老化细胞中与自噬相关的蛋白如LC3-Ⅱ和Beclin-1 的表达，并降低了mTOR 磷酸化[12]。我们认为健脾益气方中党参、甘草、黄芪、茯苓中的有效活性成分可充当mTOR 抑制剂的作用，通过抑制PI3K/Akt/mTOR 通路上调自噬，特别是甘草和黄芪中的多个有效活性成分有自噬诱导作用。因此，我们猜想健脾益气方通过PI3K/Akt/mTOR 信号通路靶向自噬可能为ITP 的治疗提供新的方法。

在本研究中，我们通过网络药理学和生物信息信息学研究健脾益气方治疗ITP 的药理学机制。网络药理学分析得到22 种化合物，337 个关键靶点，多条靶基因调控途径以及TOP10 靶基因。MTOR 基因主要编码激酶mTOR，mTOR 是调节细胞自噬的关键蛋白，细胞缺氧、应激都可直接或间接通过mTOR 调节细胞自噬的发生[13]。此外，PI3K/Akt 通路是调节mTOR 的主要上游信号通路之一。最近的研究表明，ITP 中的血小板自噬受PI3K/Akt/mTOR 通路调节，mTOR 作为负调节因子，Ⅲ类PtdIns3K 在该过程中起关键作用[14]。增强血小板自噬通过抑制细胞凋亡和提高血小板活力来减轻血小板破坏。因此我们可以推测，ITP 患者存在PI3K/Akt/mTOR 异常导致自噬功能减轻，而健脾益气方有可能通过对ITP 血小板的自噬调节从而起到治疗作用。

为了进一步探讨健脾益气方有可能通过哪些关键靶点调节血小板自噬治疗ITP，根据各活性成分靶点计数分析，EGFR、PARP1、MOTR、BCL2L1、RAF1、BCL2、HDAC6 等可能是健脾益气方治疗ITP 调节自噬的关键靶点。EGFR 是一种酪氨酸激酶，可将细胞外信号与细胞存活、生长、增殖和分化的控制联系起来，已证明EGFR 是自噬具有细胞保护或细胞毒性作用的关键决定因素。EGFR 下游的PI3K/AKT1 轴可以通过调节自噬抑制剂mTOR 来调节自噬[15]。PARP1 可修复DNA 中的单链断裂，并在自噬调节中起重要作用。PARP1 是DNA 损伤、活性氧和饥饿诱导的自噬的重要积极调节因子。PARP1 激活和三磷酸腺苷耗竭通过AMPK 激活和mTOR 抑制介导细胞死亡和自噬[16]。BCL2L1 是线粒体中的一种跨膜分子，被认为是自噬的重要因子，通过与Beclin-1 结合抑制Beclin-1 介导的自噬[17]。RAF1 是MEK/ERK信号传导的上游调节因子，Raf/MEK/ERK 激活引起LC3B 和SQSTM1 表达增加，LC3B 和SQSTM1是关键的自噬标志物[18]。LC3B 作为一种RNA 结合蛋白和mRNA 衰减子发挥作用，是高效自噬所必需的[19]。SQSTM1 又名p62，是最早被研究发现的自噬接头蛋白，在选择性自噬中起着至关重要的作用[20]。BCL2 是自身免疫性疾病、肿瘤或损伤中自噬和细胞凋亡之间的交叉点。此外，大量研究表明BCL2 参与了多种疾病的细胞凋亡和自噬。这种参与取决于含有BCL2 的复合物的形成，在细胞应激条件下，BCL2 的减少导致与Beclin-1 的结合减少，游离Beclin-1 增加，从而促进自噬[21]。而目前的结果表明，与正常血浆相比，ITP 血浆中Beclin-1 下调，而BCL2上调[22]。HDAC6 是一种独特的Ⅱ类HDAC，研究表明HDAC6 可通过调节PI3K/Akt/mTOR 通路减轻朊病毒肽介导的神经元死亡，这种保护作用涉及自噬的激活和mTOR 信号转导的PI3K/Akt 哺乳动物靶点的调节[23]。EGFR、PARP1、MOTR、HDAC6 通过调节PI3K/Akt/mTOR 信号通路来靶向自噬，而RAF1、BCL2L1 和BCL2 作为自噬的重要因子调节自噬。所以，我们认为健脾益气方治疗ITP，可能通过调节PI3K/Akt/mTOR 信号通路或调节自噬的关键蛋白来完成。

综上所述，本研究通过网络药理学和生物信息学分析表明，传统中医药组分健脾益气方通过调节PI3K/Akt/mTOR 信号通路或自噬的关键蛋白来靶向自噬可能为ITP 提供一种有前景的治疗方法。EGFR、PARP1、MOTR、BCL2L1、RAF1、BCL2、HDAC6等分子可能是健脾益气方诱导自噬，抑制血小板凋亡，治疗ITP 的关键靶点。但其具体的调控机制和关键的靶点还有待实验研究进一步证实。